En syngeneisk murinmodell av endometrios med naturligt cyklande möss
Summary
Många gnagare modeller av endometrios begränsas av teknisk komplexitet, reproducerbarhet och/eller behov av immunkomprometterade djur eller speciella reportermöss. Vi presenterar ett förenklat system av lesion induktion med hjälp av någon experimentell mus med ett oberoende verifierbart, objektiva poängsystem och utan krav på ovariectomy eller överlevnad kirurgi.
Abstract
Endometrios är en ledande orsak till bäckensmärta och infertilitet. Det definieras av förekomsten av endometrievävnad på extrauterin platser. Utvecklingen av nya terapier och diagnostiska verktyg för endometrios har begränsats delvis på grund av utmaningar i att studera sjukdomen. Utanför primater menstruerar få däggdjur, och ingen utvecklar spontan endometrios. Gnagare modeller är populära men kräver konstgjord induktion av endometrios, med många använder antingen immunkomprometterade möss eller kirurgiskt inducerad sjukdom. Nyligen har mer uppmärksamhet lagts på modeller som involverar intraperitoneal injektion. Vi presenterar en murinmodell av endometrios som integrerar flera funktioner i befintliga endometriosmodeller i ett nytt, förenklat system som förlitar sig på mikroskopisk kvantifiering i stället för subjektiv gradering. I denna modell utför vi hormonell stimulering av donatormöss, intraperitoneal injektion, systematisk bukundersökning och vävnadsskörd och histologic kvantifiering som kan utföras och verifieras när som helst efter obduktion. Denna modell kräver minimala resurser och utbildning. kräver inte expertis från labbtekniker vid murinöverlevnadskirurgi eller vid identifiering av grova endometriotiska lesioner, kan användas i immunkomprometterade, immunkompetenta och/eller muterade möss, och på ett tillförlitligt sätt skapar endometriotiska skador som är histologiskt förenliga med mänskliga endometriotisk sjukdom.
Introduction
Endometrios är en gåtfull sjukdom i det kvinnliga reproduktionssystemet med betydande ekonomiska och hälsomässiga bördor på kvinnor1,2. Etiologin av endometrios är inte helt klarlagt, och flera förklaringar har föreslagits inklusive coelomic metaplasi, embryonala Müllerian vilar, rekrytering av benmärg härledda stamceller och bakåtsträvande menstruation3. Medan flera aspekter av dessa föreslagna mekanismer kan vara inblandade, och ingen enskild förklaring kan förklara alla former av sjukdomen, är den ledande modellen av endometrios patogenes retrograd menstruation. Retrograd menstruation är passagen av menstruationsutflöde genom äggledarna och in i peritonealhålan; det uppskattas att 90% av menstruerande kvinnor regelbundet genomgår retrograd menstruation4,5. Med tanke på detta vanliga fenomen av bakåtsträvande menstruation, varför endometrios utvecklas endast i en delmängd av kvinnor är oklart5. För att bättre förstå etiologin av denna sjukdom är direkta mänskliga studier inte genomförbara och djurstudier är motiverade.
Endometrios är en utmaning både att behandla och studera. Prevalensen av sjukdomen är inte känd men uppskattas till 10%1. Medan vissa avancerade typer av endometrios kan identifieras noggrant genom noninvasive imaging, uppnås en slutgiltig diagnos endast genom histopatologisk analys av kirurgiskt erhållna biopsi exemplar. lesioner som visuellt verkar vara sjuka, kan i själva verket vara fibros eller ärrbildning från andra orsaker6. Sjukdomens svårighetsgrad och omfattning korrelerar inte med symptomatologi7.
Endometriosskador består av heterogena celltyper och populationer som interagerar på komplexa sätt inom mikromiljön, vilket begränsar nyttan av cellulära modeller8,9. In vivo-modeller finns, men dessa har inneboende utmaningar ochbegränsningar 10,11,12. Primatmodeller är idealiska men är ofta integenomförbara 13,14,15. Få icke-primat däggdjur menstruerar och utvecklar endometrios spontant16. Gnagare modeller av endometrios finns men var och en har begränsningar17. Många av dessa modeller kräver överlevnadskirurgi för sutur eller implantat endometrievävnad i donatormottagaren vägg eller tarm, lägger till teknisk komplexitet, behov av anestesi och förvirrar immunfaktorer från själva operationen18,19,20. Dessutom kräver många modeller ovariectomy och östrogen tillskott; samtidigt öka lesion avkastning, detta lägger tid, kostnader och ytterligare överlevnad kirurgi. Intraperitoneal (IP) injektionsmodeller kräver inte anestesi eller överlevnad kirurgi, och dessa modeller simulerar logiskt bakåtsträvande menstruation bättre än suturing modeller21,22,23. De flesta IP-modeller, dock, är föremål för mer variation i lesion plats på grund av slumpmässig spridning av livmodercancer fragment efter injektion och därför för att mer partiskhet i lesion identifiering och mätning.
Här presenterar vi en murinmodell av endometrios som integrerar flera funktioner i befintliga endometriosmodeller i ett nytt, förenklat och effektivt system som förlitar sig på mikroskopisk kvantifiering i stället för subjektiv gradering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår studie visar att endometrios kan induceras tillförlitligt hos möss utan att kräva användning av ovariectomy och/eller överlevnad kirurgi, och att ectopic endometrial skador kan identifieras och kvantifieras med hjälp av en standardiserad undersökning av buken och histologic analys.
Många murin studier av endometrios använder kirurgiskt inducerad endometrios där givaren endometrium sutu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Reizes-laboratoriet för deras kritiska granskning och insikter under utarbetandet av manuskriptet, samt imaging- och histologikärnorna vid Lerner Research Institute för deras hjälp med datainsamling och dataanalys. Detta arbete stöddes genom en intern bidragsfinansiering genom forskningsprogramkommittén vid Cleveland Clinic och genom ett externt bidrag genom Society for Reproductive Investigation och Bayer. Forskning i Reizes Laboratory finansieras också genom VeloSano Bike to Cure, Center of Research Excellence i gynekologisk cancer, och genom Laura J. Fogarty Endowed Chair for Uterine Cancer Research. Cleveland Clinic äger upphovsrättstillståndet för figur 1 och figur 2.
Materials
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A. Endometriosis. England Journal of Medicine. 382 (13), 1244-1256 (2020).
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C. Clinical practice. Endometriosis. New England Journal of Medicine. 362 (25), 2389-2398 (2010).
- D’Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R. Clinical management of endometriosis. Obstetrics and Gynecology. 131 (3), 557-571 (2018).
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al. Endometriosis. Endocrine Reviews. 40 (4), 1048-1079 (2019).
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women’s Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
