आवर्तक यूपीईसी यूटीआई को प्रेरित करने के लिए अव्यक्त इंट्रासेल्युलर मूत्राशय जलाशयों और बाद में मूत्राशय के संपर्क में जी योनि के संपर्क को स्थापित करने के लिए यूरोपैथोजेनिक ई कोलाई (यूपीईसी) ट्रांसयूरेथ्रल टीकाकरण का एक माउस मॉडल प्रदर्शित किया जाता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को स्कैन करने के लिए बैक्टीरिया, मूत्र कोशिका विज्ञान और सीटू मूत्राशय निर्धारण और प्रसंस्करण की गणना भी प्रदर्शित की जाती है।
यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) के कारण आवर्तक मूत्र पथ के संक्रमण (आरयूटीआई) आम और महंगे हैं। नर और मादा चूहों में यूटीआई के मॉडल का वर्णन करने वाले पिछले लेखों ने मूत्र और ऊतकों में जीवाणु टीकाकरण और गणना के लिए प्रक्रियाओं को चित्रित किया है। 6 चूहों में प्रारंभिक मूत्राशय संक्रमण के दौरान, यूपीईसी मूत्राशय उपकला कोशिकाओं के अंदर अव्यक्त जलाशयों की स्थापना करता है जो यूपीईसी बैक्टीरिया की निकासी के बाद भी बने रहते हैं। यह मॉडल अव्यक्त मूत्राशय जलाशयों के भीतर से यूपीईसी के उद्भव के कारण आरयूटीआई की जांच करने के लिए इन अध्ययनों पर बनाता है। मूत्रजननांग जीवाणु गार्डनेरेला योनिलिस का उपयोग इस मॉडल में आरयूटीआई के ट्रिगर के रूप में किया जाता है क्योंकि यह अक्सर महिलाओं के मूत्रजननांग पथ में मौजूद होता है, खासकर योनि डिस्बिओसिस के संदर्भ में जो यूटीआई से जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, मूत्राशय के ऊतकों के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) विश्लेषण को स्कैन करने के बाद सीटू मूत्राशय निर्धारण के लिए एक विधि का भी वर्णन किया गया है, मूत्राशय से जुड़े अन्य अध्ययनों के लिए संभावित अनुप्रयोग के साथ।
मूत्र पथ के संक्रमण (यूटीआई) दुनिया भर में एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य देखभाल बोझ लगाते हैं, जो हर साल लाखों लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करते हैं, विशेष रूप से महिलाएं1. यूरोपैथोजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (यूपीईसी) यूटीआई1 का सबसे लगातार कारण है। यूटीआई विकसित करने वाले कई रोगियों (लगभग 20-30%) कोप्रारंभिक संक्रमण की एंटीबायोटिक-मध्यस्थता निकासी के बावजूद 6 महीने के भीतर आवर्तक यूटीआई (आरयूटीआई) का अनुभव होगा। दुर्भाग्य से, प्रीमेनोपॉज़ल महिलाओं में से 5% हर साल 3 या अधिक आरयूटीआई से पीड़ितहोती हैं। आरयूटीआई के अनुक्रमिक एपिसोड इंडेक्स केस 5,6,7,8 से एक ही यूपीईसी तनाव की दृढ़ता के कारण हो सकते हैं। मानव नमूनों और माउस मॉडल के आंकड़ों से पता चलता है कि मूत्राशय में क्विसेंट जलाशयों के भीतर रहने वाले यूपीईसी के कारण समान तनाव आरयूटीआई हो सकता है। मनुष्यों में, यूटीआई 9,10,11,12,13 के रोगियों की उपकला कोशिकाओं और मूत्राशय बायोप्सी में यूपीईसी का पता चला था। सी 57 बीएल / 6 चूहों में अध्ययन से पता चला है कि यूपीईसी के कुछ उपभेद मूत्राशय में क्विसेंट इंट्रासेल्युलर जलाशयों को स्थापित कर सकते हैं, जैसा कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और मूत्राशय के ऊतकों के समरूपता और संस्कृति द्वारा पता लगाया गया है, जो बैक्टीरिया14,15,16 के संकल्प के बाद महीनों तक बनाए रखा जाता है। एजेंटों के साथ मूत्राशय का उपचार जो मूत्राशय उपकला (यूरोथेलियम) के छूटने को प्रेरित करता है, उदाहरण के लिए प्रोटामाइन सल्फेट17 या चिटोसन18, जलाशयों से यूपीईसी के उद्भव को ट्रिगर करता है ताकि आरयूटीआई का कारण बन सके। इन आंकड़ों से पता चलता है कि पूर्व संक्रमण से मूत्राशय यूपीईसी जलाशयों को आश्रय देने वाली महिलाओं में, मूत्राशय के संपर्क में आने से यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन आरयूटीआई ट्रिगर हो सकता है।
बढ़ते सबूत हैं कि योनि माइक्रोबायोटा मूत्र पथ के संक्रमण19,20 में योगदान देता है। गार्डनेरेला योनि योनि 21,22,23,24,25,26,27,28,29 दोनों का लगातार सदस्य है। योनि में, जी योनिलिस के उच्च स्तर की उपस्थिति एक माइक्रोबियल डिस्बिओसिस से जुड़ी होती है जिसे बैक्टीरियल वेजिनोसिस (बीवी) के रूप में जाना जाता है, जो ~ 30% महिलाओं 30,31,32 को प्रभावित करता है। लैक्टोबैसिलस33,34,35,36,37 के प्रभुत्व वाले योनि समुदाय वाली महिलाओं की तुलना में बीवी वाली महिलाओं को यूटीआई का अनुभव करने का अधिक खतरा होता है। माउस मॉडल में, जी योनि योनि 38 और मूत्राशय39 में उपकला छूटना का कारण बनता है। यूपीईसी मूत्राशय जलाशयों को आश्रय देने वाले सी 57 बीएल / 6 चूहों में, जी योनिलिस के लिए दो अनुक्रमिक मूत्राशय एक्सपोजर – लेकिन पीबीएस के लिए नहीं – यूपीईसी आरयूटीआई का कारण बनने के लिए जलाशयों से यूपीईसी के पुन: उद्भव के परिणामस्वरूप। उद्भव चूहों से मूत्र में यूपीईसी टाइटर्स की उपस्थिति से प्रमाणित होता है जो पहले यूपीईसी बैक्टीरिया को हल कर चुके थे और पीबीएस-उजागर नियंत्रण जानवरों39 की तुलना में बलिदान पर यूपीईसी मूत्राशय होमोजेनेट टाइटर्स में बाद में कमी आई थी। दिलचस्प बात यह है कि मूत्राशय में जी योनिलिस द्वारा स्थायी उपनिवेशण नहीं है। अधिकांश मामलों में, दो छोटे एक्सपोज़र, प्रत्येक मूत्र में व्यवहार्य जी योनिलिस के 12 (एच) से कम के साथ, यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन को प्राप्त करने और आरयूटीआई को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त हैं।
यह प्रोटोकॉल पुनरावृत्ति को ट्रिगर करने के लिए जी योनि मूत्राशय टीकाकरण का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर मूत्राशय जलाशयों में रहने वाले यूपीईसी के कारण आरयूटीआई के एक माउस मॉडल का वर्णन करता है। इस मॉडल द्वारा प्राप्त अग्रिम यह है कि जी योनिलिस पहले इस्तेमाल किए गए रासायनिक एजेंटों की तुलना में आरयूटीआई का नैदानिक रूप से प्रासंगिक जैविक ट्रिगर है। इसके अलावा, माउस मूत्र पथ में जी योनि का अपेक्षाकृत अल्पकालिक अस्तित्व यूरोथेलियम पर क्षणिक माइक्रोबियल एक्सपोजर के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है, जैसा कि यौन गतिविधि के बाद हो सकता है। आरयूटीआई मॉडल को रेखांकित करने के अलावा, यह प्रोटोकॉल मूत्र कोशिका विज्ञान और सीटू मूत्राशय निर्धारण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) को स्कैन करके यूरोथेलियम के इमेजिंग के तरीकों का भी वर्णन करता है।
योनि-प्रेरित आवर्तक यूपीईसी यूटीआई का यह प्रोटोकॉल यूपीईसी तनाव यूटीआई 89 का उपयोग करता है जो एक कनामाइसिन प्रतिरोध कैसेट (यूटीआई 89केएनआर) 40 को प्रभावित करता है। परीक्षण किए गए यूपीईसी के सभी उपभेद चूहों41 में तीव्र संक्रमण चरण के दौरान इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया समुदायों को बनाने में सक्षम नहीं थे और यह अभी तक ज्ञात नहीं है कि यूपीईसी के सभी उपभेदों में अव्यक्त इंट्रासेल्युलर जलाशयों को बनाने की क्षमता है या नहीं। मॉडल में अन्य यूपीईसी उपभेदों के उपयोग से पहले जलाशय गठन की पुष्टि की जानी चाहिए। यह प्रोटोकॉल एक सहज स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी जी योनिलिस आइसोलेट, जेसीपी 8151 बीएसएमआर 38 का उपयोग करता है। जेसीपी 8151 बीएसएमआर द्वारा आरयूटीआई के प्रेरण के लिए दो अनुक्रमिक जी योनि टीकाकरण की आवश्यकता होती है, जो39 के अलावा 12 घंटे या 7 दिन (डी) दिए जाते हैं। योनि उपभेदों को एक्सफोलिएशन और / या यूपीईसी आरयूटीआई को प्रेरित करता है या नहीं, इस मॉडल के साथ निर्धारित किया जाना बाकी है। ज्ञात एंटीबायोटिक प्रतिरोध (जैसे यूपीईसी के लिए कनामाइसिन या स्पेक्टिनोमाइसिन और जी योनिलिस के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ यूपीईसी और जी योनि उपभेदों का उपयोग करना आवश्यक है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं को अंतर्जात माउस माइक्रोबायोटा के विकास को रोकने के लिए अगर प्लेटों में जोड़ा जा सकता है जो अन्यथा संक्रमण की निगरानी के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यह मूत्र के नमूनों को संवर्धन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि माउस मूत्र में अक्सर अन्य बैक्टीरिया होते हैं जो एंटीबायोटिक दवाओं के बिना संस्कृति प्लेटों पर बढ़ सकते हैं। माउस मूत्र में इन अंतर्जात बैक्टीरिया की उत्पत्ति अज्ञात है, लेकिन संभवतः मूत्र संग्रह के दौरान उठाए गए पेरियूरेथ्रल और मूत्रजननांग बैक्टीरिया को दर्शाता है।
योनि एक संकाय अवायवीय जीवाणु है और इसलिए, यह प्रोटोकॉल एक अवायवीय कक्ष में बढ़ते जी योनिलिस जेसीपी 8151 बीएसएमआर का वर्णन करता है। यदि एक एनारोबिक कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो अवायवीय विकास की स्थिति (जैसे कि एक एयरटाइट कंटेनर में गैसपैक पाउच) को बनाए रखने के लिए अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, जी योनिलिस (जेसीपी 8151 बीएसएमआर सहित) के कुछ उपभेद एक मानक ऊतक-संस्कृति इनक्यूबेटर (5% सीओ2) में बढ़ेंगे। जैसे ही जेसीपी 8151 बीएसएमआर के अलावा जी योनि उपभेदों का उपयोग करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण की आवश्यकता होती है कि बैक्टीरिया इस मॉडल में समान व्यवहार करते हैं, विकास की स्थिति को बदलने के लिए संस्कृति (प्लेटों पर और तरल में) और ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 600 समकक्षों के लिए आदर्श अवधि के अनुभवजन्य निर्धारण की आवश्यकता होती है ताकि वांछित व्यवहार्य इनोकुलम सांद्रता प्राप्त की जा सके। इसके अलावा, यह ज्ञात नहीं है कि विकास की स्थिति जी योनि विज्ञान के रोग विज्ञान को प्रभावित करती है या नहीं।
अंत में, इस मॉडल का उपयोग करने पर विचार करते समय, शोधकर्ताओं को पता होना चाहिए कि इसे विशिष्ट यूटीआई माउस मॉडल की तुलना में प्रति समूह बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता हो सकती है। यह आंशिक रूप से है क्योंकि आरयूटीआई के प्रेरण के लिए आवश्यक है कि चूहे मूत्राशय के प्रारंभिक संक्रमण के कारण यूपीईसी बैक्टीरिया को हल करें। इस प्रकार, कोई भी माउस जो बैक्टीरिया को साफ करने में विफल रहता है (एक फेनोटाइप आमतौर पर चल रहे गुर्दे के संक्रमण का संकेत देता है) प्रोटोकॉल के आरयूटीआई चरण में शामिल नहीं है। इन अध्ययनों को शक्ति देने के लिए आवश्यक चूहों की संख्या मूत्र में “सहज” यूपीईसी उद्भव की दर (औसतन 12-14%) से भी प्रभावित होती है। अंत में, विभिन्न माउस उपभेदों में क्रोनिक बैक्टीरिया बनाम इंट्रासेल्युलर जलाशय गठन42,43 विकसित करने के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियां हैं। यदि इस मॉडल में सी 57 बीएल / 6 के अलावा माउस उपभेदों का उपयोग करते हैं, तो यह पुष्टि की जानी चाहिए कि जानवर शांत यूपीईसी इंट्रासेल्युलर जलाशयों का विकास करते हैं।
प्राथमिक यूटीआई चरण के दौरान यूपीईसी बैक्टीरिया को साफ नहीं करने वाले चूहों की पहचान करने के लिए इस मॉडल में पहला महत्वपूर्ण कदम। इन चूहों को प्रयोग से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि वे अन्यथा जी योनि के संपर्क के बाद यूपीईसी बैक्टीरिया की दरों को भ्रमित करेंगे। प्रारंभिक यूपीईसी टीकाकरण के बाद, बैक्टीरिया निकासी की निगरानी के लिए मूत्र को साप्ताहिक रूप से एकत्र किया जाना चाहिए। सी 57 बीएल / 6 चूहों का लगभग 65-80% 4 सप्ताह के भीतर यूटीआई 89केएनआर संक्रमण को साफ कर देगा। अन्य इनब्रेड माउस उपभेदों में यूपीईसी निकासी42,43 और जलाशय गठन के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियां हैं और इस प्रकार इस मॉडल के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि अनुभवजन्य अध्ययनों ने निर्धारित किया है कि जी योनिलिस (या तो 12 घंटे या 1 डब्ल्यूके अलग) के दो अनुक्रमिक टीकाकरण पृष्ठभूमि सहज उद्भव के ऊपर महत्वपूर्ण जलाशय उद्भव को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक हैं जो केवल पीबीएस के संपर्क में नियंत्रण चूहों में होता है। दो अनुक्रमिक एक्सपोज़र के बीच समय की अन्य अवधि का परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन समान परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यूपीईसी मूत्राशय टाइटर्स में कमी केवल उस मॉडल में देखी गई थी जिसमें जी योनि संबंधी एक्सपोजर को39 के अलावा 1 डब्ल्यूके दिया गया था। जबकि दो से अधिक एक्सपोज़र प्रशासित किए जा सकते हैं, अनुभवजन्य साक्ष्य बताते हैं कि बार-बार कैथीटेराइजेशन अकेले उद्भव को बढ़ाता है, जो परिणामों की व्याख्या को भ्रमित कर सकता है या एक्सपोज़र समूहों और नियंत्रणों के बीच अंतर को अलग करने के लिए बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है। अंत में, इन सीटू मूत्राशय निर्धारण विधि में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ कौशल की आवश्यकता होती है कि फिक्सेटिव क्लैंप किए गए मूत्राशय के अंदर रहता है। एसईएम द्वारा अपस्फीत मूत्राशय की छवि बनाना अधिक कठिन होगा। मूत्राशय में फिक्सेटिव को टीका लगाते समय बहुत कोमल होना भी आवश्यक है, क्योंकि फिक्सेटिव युक्त कैथेटर के साथ यूरोथेलियम को स्क्रैप करने से यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन प्रेरित हो सकता है जो जी। फिक्सेटिव कॉकटेल में उल्लिखित सभी सांद्रता अंतिम सांद्रता हैं। इनमें से अनुचित अनुपात के परिणामस्वरूप अपर्याप्त फिक्सिंग और सूजन या कोशिकाओं का संकोचन हो सकता है। कोशिकाओं और ऊतकों में तापमान के झटके से बचने के लिए फिक्सेटिव को शारीरिक तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए। वार्मिंग प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से फिक्सेटिव की प्रसार दर में मामूली सुधार भी प्रदान करता है। जबकि एसईएम विश्लेषण के लिए तैयार नमूनों के लिए ऑस्मियम धुंधला अक्सर छोड़ा जा सकता है, यह लिपिड को स्थिर करने और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के दौरान सेलुलर झिल्ली के क्रैकिंग को रोकने के लिए इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है।
इस प्रोटोकॉल को जलाशयों को बनाने और क्रमशः उनके उद्भव को ट्रिगर करने की उनकी क्षमता के लिए अन्य यूपीईसी और / या जी योनि उपभेदों का परीक्षण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। अन्य प्रयोगात्मक कारकों को भी जोड़ा जा सकता है, जैसे कि अन्य योनि बैक्टीरिया (जैसे, लैक्टोबैसिलस क्रिस्पेटस पीवीएएस 100) या गर्मी से मारे गए जी योनिलिस के संपर्क में, जिनमें से कोई भी इस मॉडल39 में विकृति का प्रदर्शन नहीं करता है। परीक्षण करने के लिए अन्य जीवाणु उपभेदों का चयन करते समय, लगातार विकास का प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है जैसे कि सभी प्रयोगों में एक मानक इनोकुलम एकाग्रता का उपयोग किया जा सकता है। जेसीपी 8151 बीएसएमआर की वृद्धि को एक एनारोबिक चैंबर में अनुकूलित किया गया है। इस तनाव की खेती संभवतः एक एनारोबिक गैसपैक प्रणाली में की जा सकती है, लेकिन इसके लिए मजबूत जीवाणु विकास सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। अंत में, मॉडल में कुछ चरणों के समय को संशोधित करना संभव हो सकता है। उदाहरण के लिए, सीएफयू या मेजबान प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए यूपीईसी जलाशय गठन चरण के दौरान मूत्र को पहले के समय बिंदुओं पर एकत्र किया जा सकता है। संक्रमण की प्रगति या जलाशयों की स्थापना पर प्रारंभिक समय बिंदुओं (3, 6, 12 एचपीआई) पर मूत्र के नमूने एकत्र करने का प्रतिकूल प्रभाव इस मॉडल में नहीं देखा गया है। यूपीईसी जलाशयों का उद्भव दो जेसीपी 8151 बीएसएमआर खुराक के बाद होने की सूचना मिली है, जो 12 घंटे या 1 डब्ल्यूके दिए गए हैं, लेकिन अन्य समय अंतराल अभी तक परीक्षण नहीं किए गए हैं। यूपीईसी जलाशय गठन चरण को 2 सप्ताह (4 सप्ताह के बजाय) तक कम करके मॉडल के लिए समय की समग्र लंबाई को कम करना भी संभव हो सकता है, क्योंकि कई चूहे इस समय तक बैक्टीरिया को साफ करते हैं। रासायनिक एक्सफोलिएंट्स के मूत्राशय के संपर्क के बाद यूपीईसी उद्भव की जांच करने वाले पिछले अध्ययनों ने 1 या 2 डब्ल्यूके यूपीईसी जलाशय गठन चरण17,18 का उपयोग किया। हालांकि, यूपीईसी बैक्टीरिया निकासी के लिए समय की मात्रा को कम करना प्रयोग से अधिक जानवरों को मारने की आवश्यकता की कीमत पर आ सकता है। अंत में, मूत्राशय का एसईएम विश्लेषण यूरोथेलियम पर जी योनिलिस के प्रभाव की अवधि का निरीक्षण करने के लिए अतिरिक्त समय बिंदुओं पर किया जा सकता है।
समस्या निवारण के संबंध में, मूत्राशय एसईएम विश्लेषण के संबंध में विशेष रूप से कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। उपयोग की जाने वाली माउस पृष्ठभूमि और सूजन की मात्रा के आधार पर, कुछ मूत्राशय बहुत पतली दीवारों के साथ पेश करेंगे। ये मूत्राशय महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के दौरान अधिक कर्ल करते हैं और इसके परिणामस्वरूप कौड़ी खोल जैसा आकार हो सकता है। यदि ऐसा होता है, तो सबसे अच्छा तरीका कर्ल इंटरफ़ेस के साथ शेल के आकार के मूत्राशय को आधे में काटना है और फिर ओवरहैंगिंग ऊतक के थोक को हटाने के लिए दूसरी बार है। कटिंग पीटीएफई-लेपित डबल-धार वाले रेजर ब्लेड के साथ सबसे अच्छा काम करता है। अतिरिक्त वसा कभी-कभी ऑस्मियम धुंधला चरणों के दौरान घुलनशील हो सकता है। इसके परिणामस्वरूप अवांछित अघुलनशील वसा की बूंदें हो सकती हैं जो कुल्ला और निर्जलीकरण चरणों के दौरान नहीं धो सकती हैं और जो बाद में सुखाने के दौरान मूत्राशय की सतह पर बस सकती हैं। ये बूंदें या तो छोटे गोले या नमूने (चित्रा 4 डी) पर बिखरे हुए डिस्क जैसी संरचनाओं के रूप में दिखाई दे सकती हैं। यह सुनिश्चित करके कम किया जा सकता है कि मूत्राशय के चारों ओर से जितना संभव हो उतना वसा ऊतक हटा दिया जाए। प्लैटिनम को इरिडियम कोटिंग के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन ठीक संरचनात्मक विवरणों के मास्किंग को कम करने के लिए मोटाई को कम से कम रखा जाना चाहिए। कोटिंग के दौरान घूर्णन चरण के उपयोग की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
इस मॉडल की एक सीमा यह है कि इसके लिए बड़ी संख्या में चूहों की आवश्यकता होती है। 6 चूहों का केवल 65-80% अपने यूपीईसी बैक्टीरिया को साफ करेगा और बाद में जी योनि या पीबीएस टीकाकरण के लिए उपयुक्त होगा (चित्रा 2 सी देखें)। प्रति समूह 10-12 चूहों (जी योनि टीकाकरण बनाम पीबीएस) प्राप्त करने के लिए, ~ 30 चूहों को शुरू में यूपीईसी से संक्रमित होना चाहिए। इसके अलावा, सांख्यिकीय महत्व का पता लगाने के लिए आवश्यक जैविक प्रतिकृतियों को प्राप्त करने के लिए कई प्रयोगों की आवश्यकता होती है। जब एक्सपोज़र को 1 डब्ल्यूके अलग दिया गया था, तो यूपीईसी उद्भव पीबीएस (चित्रा 3 बी) के संपर्क में आने वाले चूहों के 14% में हुआ। इस प्रकार, जी योनि में यूपीईसी आरयूटीआई में महत्वपूर्ण वृद्धि का पता लगाने से पीबीएस नियंत्रण (0.8; अल्फा = 0.05 [एकतरफा]) के सापेक्ष चूहों को उजागर किया जाता है) प्रत्येक एक्सपोजर समूह के लिए कम से कम 40 चूहों के संचयी कुल का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। एक अतिरिक्त विचार यह है कि ये प्रयोग महंगे और श्रम-गहन हैं। चूहों को यूपीईसी निकासी के लिए साप्ताहिक निगरानी की जानी चाहिए और प्रयोगात्मक समय पाठ्यक्रम 4-5 डब्ल्यूके है जो इस बात पर निर्भर करता है कि जी योनिलिस को 12 घंटे की समय सीमा में दो बार या दो बार 1 डब्ल्यूके अलग दिया जाता है या नहीं। एसईएम श्रम-गहन है और माइक्रोस्कोप उपलब्धता और सेवा शुल्क के आधार पर महंगा हो सकता है। एसईएम के लिए पूरे मूत्राशय को तैयार करना विश्लेषण के लिए प्रचुर मात्रा में सामग्री प्रदान करता है लेकिन दोष यह है कि प्रत्येक मूत्राशय का विश्लेषण समय लेने वाला हो सकता है। इस प्रकार, यह संभावना है कि मूत्र और ऊतक टाइटर्स के लिए उपयोग की जाने वाली उच्च पशु संख्या की तुलना में एसईएम द्वारा केवल सीमित संख्या में मूत्राशय का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, मूत्राशय “कप” की घुमावदार सतहों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए छाया के कारण कौशल की आवश्यकता होती है जो दृश्यता को बाधित कर सकती है। यद्यपि मूत्राशय एसईएम यूरोथेलियल छूटना की कल्पना करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, यह विधि काफी हद तक गुणात्मक है। क्योंकि नमूना एक गोल आकार में तय किया गया है, और फिक्सेटिव में ग्लूटाराल्डिहाइड के उपयोग के कारण, प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फ्लोरोसेंटली व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया के लिए स्क्रीनिंग संभव नहीं है। इम्यूनोस्टेनिंग और रासायनिक रंग ग्लूटाराल्डिहाइड के उपयोग के कारण इस प्रक्रिया के साथ असंगत हैं जो अधिकांश एंटीजन और ऑस्मियम को क्रॉसलिंक करेंगे और यह एंटीजन साइटों को मुखौटा करेगा और ऊतक को अंधेरा कर देगा। उस ने कहा, एसईएम तकनीक उन मापदंडों के लिए उपयोगी है जिन्हें अतिरिक्त जांच के उपयोग के बिना मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसे कि सेल आकार48,49।
यह मॉडल पहले वर्णित विधियों से परे कई फायदे प्रदान करता है। यह मूत्राशय जलाशयों से उभरने के कारण यूपीईसी आरयूटीआई के तंत्र की परीक्षा की अनुमति देता है, जैसा कि बाहरी स्रोत से मूत्राशय में पुन: परिचय के विपरीत है। मूत्राशय जलाशयों से उभरने के कारण आरयूटीआई के अन्य मॉडल रासायनिक एजेंटों (प्रोटामाइन सल्फेट या चिटोसन) का उपयोग यूरोथेलियल एक्सफोलिएशन17,18 का कारण बनते हैं, जो महिलाओं में आरयूटीआई के ट्रिगर नहीं होंगे। योनि एक प्रचलित मूत्रजननांग जीवाणु है जो कुछ महिलाओं में कैथीटेराइजेशन या सुपरप्यूबिक आकांक्षा के माध्यम से मूत्राशय से सीधे एकत्र मूत्र में पाया गयाहै 23,26. यह तथ्य, बीवी (जिसमें जी योनि योनि में उगता है) और यूटीआई के बीच ज्ञात सहयोग के साथ मिलकर, यह सुझाव देता है कि जी योनि आरयूटीआई का नैदानिक रूप से प्रशंसनीय ट्रिगर है। अंत में, इन सीटू मूत्राशय निर्धारण विधि मूत्राशय अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करती है और क्षति को सीमित करती है, यह सुनिश्चित करती है कि मूत्राशय की परतें एक दूसरे से अलग न हों। यूरोथेलियम की कल्पना करने के लिए पिछले तरीकों में पारंपरिक रूप से उपयोगकर्ता को फिक्सेटिव48 में फैले मूत्राशय को डुबोने से पहले मूत्राशय को विच्छेदन ट्रे पर कटाई, द्विभाजन, खिंचाव और पिन करना होता है। इस विधि के परिणामस्वरूप एक बहुत ही सपाट नमूना होता है लेकिन ऊतक के समान या प्राकृतिक खिंचाव सुनिश्चित नहीं होता है और इसके परिणामस्वरूप ऐसे क्षेत्र हो सकते हैं जो अधिक और नीचे फैले हुए हैं (जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक झुर्रीदार ऊतक होते हैं) और मूत्राशय की परत पृथक्करण का कारण बन सकते हैं। इसके अतिरिक्त, ऊतक को फैलाने और पिन करने के लिए मूत्राशय के ये शारीरिक जोड़तोड़ यूरोथेलियल छूटना सहित नुकसान पहुंचा सकते हैं। एक अन्य विधि पैराफिन में एम्बेड करने और माइक्रोटोम के साथ पतले वर्गों को प्राप्त करने से पहले फिक्सेटिव में बरकरार मूत्राशय को डुबोना है। बैक्टीरिया और मेजबान प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों के लिए पतले खंड अमूल्य हैं लेकिन एक पतला खंड यूरोथेलियल सतह के दृश्य की अनुमति नहीं देता है। यह एसईएम विधि पूरे मूत्राशय की सतह को एक बार में जांचने की अनुमति देती है।
जैसा कि वर्णित है, इस मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोगों में यह निर्धारित करने के लिए अन्य यूपीईसी उपभेदों का परीक्षण करना शामिल है कि क्या वे इंट्रासेल्युलर जलाशय बनाते हैं और अन्य जी योनि उपभेदों का परीक्षण करते हैं ताकि यह आकलन किया जा सके कि क्या वे आरयूटीआई का कारण बनने के लिए छूटना और यूपीईसी उद्भव प्राप्त करते हैं। 6 चूहों से परे अन्य माउस उपभेदों का भी परीक्षण किया जा सकता है, हालांकि क्रोनिक सिस्टिटिस (जैसे सी 3 एच पृष्ठभूमि पर चूहों) के विकास के लिए उच्च प्रवृत्ति वाले चूहों की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि बहुत सारे चूहों को प्रयोग से मारने की आवश्यकता होगी। 6 चूहों का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कई आनुवंशिक नॉकआउट उपभेद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस तरह के उपभेद जलाशय गठन और / या उद्भव में शामिल मेजबान कारकों से पूछताछ करने का अवसर प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक संक्रमण प्रयोगों में तकनीकी सहायता के लिए लिन फोस्टर, एसईएम तक पहुंच के लिए वाशिंगटन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर सेलुआर इमेजिंग (डब्ल्यूयूसीसीआई) में जेम्स फिट्जपैट्रिक, यूटीआई 89केएनआर यूपीईसी तनाव के लिए स्कॉट हल्टग्रेन और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डेविड हंस्टैड को धन्यवाद देते हैं।
यह काम नेशनल साइंस फाउंडेशन (वीपीओ # डीजीई – 1143954 के लिए ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप) द्वारा समर्थित था, वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (एनएमजी के लिए पायलट रिसर्च अवार्ड) में महिला संक्रामक रोग अनुसंधान केंद्र द्वारा, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन: #12POST12050583 (एनएमजी) और #14POST20020011 (एनएमजी), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, एनआईएआईडी: आर 01 एआई 114635 (एएलएल) और एनआईडीडीके द्वारा: आर 21 डीके 092586 (सभी), पी 50 डीके 064540-11 (एसजेएच, परियोजना द्वितीय पीआई: एएलएल) और के 01 डीके 110225-01 ए 1 (एनएमजी)। कुछ जानवरों के अध्ययन एनसीआरआर अनुदान सी 06 आरआर 015502 द्वारा समर्थित सुविधा में किए गए थे। वाशिंगटन यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर सेलुलर इमेजिंग (डब्ल्यूयूसीसीआई; जहां एसईएम का प्रदर्शन किया गया था) और एमएसजे को वाशिंगटन यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के चिल्ड्रन डिस्कवरी इंस्टीट्यूट और सेंट लुइस चिल्ड्रन हॉस्पिटल (सीडीआई-कोर-2015-505), फाउंडेशन फॉर बार्न्स-यहूदी अस्पताल (3770), और नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनएस 086741) द्वारा समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
30G x 1/2 needles | BD | 305106 | for catheters |
5 1/2" straight forcep hemostat | McKesson | 487377 | in situ bladder fixation |
ACE 600 Sputter coater | Leica | SEM sample processing | |
aluminum SEM stub | Ted Pella | 16111 | SEM sample processing |
Calcium chloride | EMS | 12340 | in situ bladder fixation |
conductive carbon adhesive tab | Ted Pella | 16084-1 | SEM sample processing |
Conductive silver paint | Ted Pella | 16034 | SEM sample processing |
CPD 300 Critical Point Drier | Leica | SEM sample processing | |
Cytofunnel metal clip | Simport | M964B | cytospun urinalysis |
Ethanol | EMS | 15050 | SEM sample processing |
Glucose | Sigma | G7528 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
glutaraldehyde | EMS | 16320 | in situ bladder fixation |
Hema 3 staining kit | Fisher | 23123869 | cytospun urinalysis |
HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | for NYCIII G. vaginalis growth media |
iridium | Ted Pella | 91120 | SEM sample processing |
isofluorane | mouse anaesthesia | ||
kanamycin | Gibco | 11815024 | add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL) |
Luria-Bertani agar | BD | DF0445174 | UPEC growth plates |
Luria-Bertani broth | BD | DF0446173 | UPEC growth media |
Merlin FE-SEM | Zeiss | scanning electron microscope | |
Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | SEM sample processing |
NaCl | Sigma | S3014 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
Olympus Vanox AHBT3 microscope | Olympus | cytospun urinalysis | |
osmium tetroxide | EMS | 19170 | SEM sample processing |
paraformaldehyde | EMS | 15710 | in situ bladder fixation |
polyethylene tubing | Intramedic | 427401 | for catheters |
Proteose Peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
PTFE coated double edge razor blade | EMS | 72000 | cutting bladders for SEM |
Shandon Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300002 | cytospun urinalysis |
Shandon cytofunnel filter | Simport | M965FWDV | cytospun urinalysis |
Shandon Double cytofunnel | Simport | M964-1D | cytospun urinalysis |
Shandon double cytoslides (coated) | Thermo Scientific | 5991055 | cytospun urinalysis |
sodium cacodylate trihydrate | EMS | 12310 | in situ bladder fixation |
spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
streptomycin | Gibco | 11860038 | add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL) |
tuberculin slip tip syringe | BD | 309659 | for catheters |
Yeast Extract | Fisher | DF0127-17-9 | for NYCIII G. vaginalis growth media |