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Immunology and Infection

由加德纳菌阴道膀胱暴露在小鼠中引发的复发性大肠杆菌尿路感染

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

展示了产尿道 大肠杆菌 （UPEC） 经尿道接种以建立潜伏细胞内膀胱储液囊的小鼠模型，随后膀胱暴露于 阴道 G. 以诱导复发性 UPEC UTI。还证明了细菌的计数，尿液细胞学检查以及原位膀胱固定和扫描电子显微镜处理。

Abstract

由泌尿致病性 大肠杆菌 （UPEC） 引起的复发性尿路感染 （rUTI） 很常见且费用高昂。以前描述雄性和雌性小鼠UTI模型的文章已经说明了尿液和组织中的细菌接种和计数程序。在C57BL / 6小鼠的初始膀胱感染期间，UPEC在膀胱上皮细胞内建立潜伏储库，这些储库在UPEC菌尿清除后持续存在。该模型建立在这些研究的基础上，以检查由潜伏膀胱储层内出现的UPEC引起的rUTI。在该模型中，泌尿生殖器细菌 加德纳菌 阴道被用作rUTI的触发因素，因为它经常存在于女性的泌尿生殖道中，特别是在与UTI相关的阴道生态失调的情况下。此外，还描述了一种原位膀胱固定然后对膀胱组织进行扫描电子显微镜（SEM）分析的方法，并有可能应用于涉及膀胱的其他研究。

Introduction

尿路感染（UTI）在全球范围内带来了巨大的医疗负担，每年影响数百万人的生活质量，尤其是女性1。尿路致病性大肠杆菌 （UPEC） 是 UTI1 的最常见病因。许多发生 UTI 的患者（约 20-30%）会在 6 个月内出现复发性 UTI （rUTI），尽管抗生素介导的初始感染已清除2。不幸的是，多达5%的绝经前妇女每年患有3次或更多的rUTI3，4。rUTI的序贯发作可能是由指示病例5，6，7，8中相同的UPEC菌株的持续存在引起的。来自人类样本和小鼠模型的数据表明，同菌株rUTI可能是由UPEC居住在膀胱的静止储层中引起的。在人类中，在UTI9，10，11，12，13患者的上皮细胞和膀胱活检中检测到UPEC。C57BL / 6小鼠的研究表明，一些UPEC菌株可以在膀胱中建立静止的细胞内储库，通过荧光显微镜和膀胱组织的匀浆和培养检测到，这些储库在菌尿14，15，16消退后维持数月。用诱导膀胱上皮剥落的药物（尿路上皮）治疗膀胱，例如硫酸鱼精蛋白17或壳聚糖18，触发UPEC从储库出现引起rUTI。这些数据表明，在既往感染中携带膀胱 UPEC 储液器的女性中，导致尿路上皮去角质的膀胱暴露可能引发 rUTI。

越来越多的证据表明，阴道微生物群会导致尿路感染19，20。阴道加德纳菌是阴道和泌尿微生物群21，22，23，24，25，26，27，28，29的频繁成员。在阴道中，高水平的阴道G.的存在与称为细菌性阴道病（BV）的微生物生态失调有关，其影响约30%的女性30，31，32。与乳酸杆菌33，34，35，36，37的阴道社区的女性相比，BV女性患UTI的风险更高。在小鼠模型中，阴道G.在阴道38和膀胱39中引起上皮去角质。在携带 UPEC 膀胱储液器的 C57BL/6 小鼠中，两次连续膀胱暴露于阴道 G. 但未暴露于 PBS - 导致 UPEC 从储集层中重新出现，导致 UPEC rUTI。与PBS暴露的对照动物相比，先前已解决UPEC菌尿的小鼠尿液中UPEC滴度的出现以及随后UPEC膀胱匀浆滴度的降低证明了这一点。有趣的是，膀胱中的阴道G.没有持久的定植。在绝大多数情况下，两次短暂暴露，每次尿液中存活的阴道 G.

该协议描述了由居住在细胞内膀胱储液器中的UPEC引起的rUTI小鼠模型，使用 阴道G. 膀胱接种来触发复发。该模型取得的进步是，与以前使用的化学试剂相比， 阴道G. 是rUTI的临床相关生物触发因素。此外，小鼠尿路阴道 球菌 的相对较短的存活率允许检查短暂微生物暴露对尿路上皮的影响，如性活动后可能发生的那样。除了概述rUTI模型外，该协议还描述了尿液细胞学和原位膀胱固定以及通过扫描电子显微镜（SEM）对尿路上皮进行成像的方法。

阴道芽孢杆菌诱导的复发性UPEC UTI的该方案使用带有卡那霉素抗性盒（UTI89kanR）的UPEC菌株UTI89 40。并非所有测试的UPEC菌株都能够在小鼠41的急性感染阶段形成细胞内细菌群落，目前尚不清楚UPEC的所有菌株是否都具有形成潜伏细胞内储库的能力。在模型中使用其他UPEC菌株之前，应确认储层的形成。该方案使用自发性链霉素耐药阴道G.分离株JCP8151BSmR38。通过 JCP8151BSmR 诱导 rUTI 需要两次连续阴道 G. 接种，间隔 12 小时或 7 天 （d）39。其他阴道芽孢杆菌菌株是否诱发去角质和/或UPEC rUTI仍有待该模型确定。必须使用具有已知抗生素耐药性的 UPEC 和阴道菌芽孢杆菌菌株（例如用于 UPEC 的卡那霉素或大观霉素以及用于阴道菌的链霉素），因为可以将抗生素添加到琼脂平板上，以防止内源性小鼠微生物群的生长，否则这些微生物群可能会干扰列举集落形成单位 （CFU） 以监测感染。这对于培养尿液标本尤其重要，因为小鼠尿液中经常含有其他细菌，这些细菌可以在没有抗生素的情况下在培养板上过度生长。这些内源性细菌在小鼠尿液中的起源尚不清楚，但可能反映了尿液收集过程中发现的尿道周围和泌尿生殖系统细菌。

阴道假单胞菌是一种兼性厌氧菌，因此，该方案描述了在厌氧室中生长的阴道菌JCP8151BSmR。如果没有厌氧室，可以使用其他方法来维持厌氧生长条件（例如气密容器中的GasPak袋）。或者，阴道芽孢杆菌的一些菌株（包括JCP8151BSmR）将在标准组织培养箱（5%CO2）中生长。正如使用除 JCP8151BSmR 以外的阴道 G. 菌株需要进行测试以确保细菌在该模型中的行为相似一样，改变生长条件需要经验性地确定培养的理想持续时间（在平板上和液体中）和光密度 （OD）600 当量，以达到所需的可行接种物浓度。此外，尚不清楚生长条件是否影响阴道 G.

最后，在考虑是否利用该模型时，研究人员应该意识到，与典型的UTI小鼠模型相比，每组可能需要更多的动物。这部分是因为诱导rUTI需要小鼠解决由膀胱初始感染引起的UPEC菌尿。因此，任何未能清除菌尿（通常表明持续肾脏感染的表型）的小鼠均不包括在方案的rUTI阶段。为这些研究提供动力所需的小鼠数量也受到“自发”UPEC进入尿液的速率（平均12-14%）的影响。最后，不同的小鼠品系与细胞内储库形成42，43具有不同的发生慢性菌尿的倾向。如果在此模型中使用C57BL / 6以外的小鼠菌株，则必须确认动物发展出静止的UPEC细胞内储库。

Protocol

华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有小鼠感染和程序，作为协议号20170081的一部分，该协议于06/09/2020到期，20-0031于2023年3月18日到期。动物的整体护理与国家研究委员会的《实验动物护理和使用指南》和美国农业部的《动物护理资源指南》一致。安乐死程序符合AVMA动物安乐死指南：2020年版。

Figure 1
图 1.小鼠模型示意图。突出显示时间线以反映协议中概述的模型的阶段或过程。阶段 1（橙色）：建立细胞内优沛接触液储层。将小鼠经尿道接种UPEC，并收集尿液样本并监测菌尿的清除。只有清除菌尿的小鼠才会进入随后的阶段。第 2 阶段（绿色）：膀胱暴露于阴道 G.小鼠经尿道接种阴道毛果杆菌两次。两个连续暴露之间的持续时间为12小时（顶部面板）或1周（wk;底部面板），具体取决于所需的下游分析。第 3 阶段（黄色）：优必凯鲁蒂。阴道 G. 暴露后每天收集尿液，并监测 UPEC 菌尿。此外，可以在实验终点收集膀胱和肾脏以测量UPEC组织滴度。在1周暴露模型中，阴道芽孢杆菌诱导的UPEC从细胞内储液囊中出现以及随后从尿路清除也反映在UPEC膀胱组织滴度的降低中（与PBS暴露的小鼠相比，见图3D）。膀胱滴度的这种降低在12小时暴露模型中并不明显，可能是因为需要更多的时间才能发生足够的储液槽和清除，以显着降低组织滴度。 程序A：通常在1期期间进行1 dpi（甚至更早）的尿液细胞学检查，以检查急性UPEC感染，并在第3阶段进行以评估尿液PMN含量，这与UPEC的出现相关。在其他时间点收集的尿液样本可以进行类似的分析。 程序B：膀胱扫描电子显微镜（SEM）检查尿路上皮去角质通常在第二次阴道G暴露后3小时（在时间0施用第一次暴露后15小时）在12小时模型中进行。还可以评估其他时间点，例如UPEC接种后6-24小时，如第1阶段所示。请点击此处查看此图的大图。

1. 在小鼠中建立UPEC静止细胞内储库

  1. 准备导尿管（有关此步骤的视频，请参阅44，45，46，47）。
    1. 螺纹 30 号针，带 PE10 管的长度，从针基延伸到针尖以外的几毫米。注意不要用针尖刺穿管子。或者，使用小儿静脉插管46。
    2. 将准备好的导管放入培养皿中，用紫外线消毒至少30分钟。更换培养皿盖并固定存放，直到需要。
  2. 准备UPEC接种物（第-3天至第0天）
    1. 第-3天：从-80°C冷冻库到卢里亚 - 贝塔尼（LB）琼脂平板上的条纹UTI89kanR 。将板在37°C孵育18-24小时。
      注意：没有必要将卡那霉素添加到接种物生长培养基中，因为卡那霉素耐药性稳定地整合到UTI89kanR中。
    2. 第-2天：在无菌的125 mL烧瓶中接种20 mL LB肉汤，其中单个菌落为UTI89kanR。 不要使用较小的烧瓶，因为这种培养方法对于诱导膀胱粘连所必需的UPEC 1型毛疧的表达很重要。
    3. 在37°C下静态孵育（不摇晃）18-24小时。不要在生长培养基中添加抗生素。仅在LB平板（18-24小时龄）上使用新鲜菌落开始液体培养。
    4. 第-1天：通过去除20μL培养物（轻轻旋转烧瓶以重悬沉的细菌）并在无菌的125mL烧瓶中加入20mL新鲜LB肉汤来传代培养UTI89kanR 。按照步骤2孵育，但固定的18小时持续时间除外。不要在生长培养基中添加抗生素。
    5. 第0天：将整个培养物转移到50 mL管中，并在台式离心机中以3200× g 旋转10分钟以沉淀细菌。吸出上清液并将细菌沉淀重悬于10mL PBS中。
    6. 在比色皿中加入步骤4至900μLPBS的浓缩细菌悬浮液中的100μL，并使用已用PBS消光的分光光度计测定600nm（OD 600）处的光密度。将分光光度计值乘以10（以考虑稀释量）以确定悬浮液（OD悬浮液）的OD600。
    7. 为了在50μL中达到所需的接种物浓度为1 x 107 CFU，请使用以下等式稀释（或浓缩）UTI89kanR 悬浮液，其中所需的OD接种物 为0.35（值可能因其他UPEC菌株而异），Y是所需的接种物体积（每只小鼠100μL，以允许额外的消除气泡和填充导管）：
      X 毫升 x 外径悬浮液 = Y 毫升 x 外径接种物
      例如，如果OD悬浮 液值为4.7，则需要5 mL接种物：
      X mL × 4.7 = 5 × 0.35
      X = （5 × 0.35） / 4.7
      X = 0.372 毫升
      因此，加入372μL细菌悬浮液以制成5 mL（最终体积）
    8. 使用多通道移液管将接种物的1：10连续稀释至96孔板中无菌PBS中的10-6 。将所有6种稀释液的5个10μL重复物点到LB和LB + kan板上，使斑点干燥，并在37°C下孵育过夜。不使用抗生素的LB板用于确保接种物不被另一种生物体污染（这将表现为kan抗生素选择板上不存在的额外菌落形态）。两种板类型应产生相同的结果。
      注意：在使用前，应在台面上干燥一天，以便它们吸收电镀液体而不会结结斑点。
    9. 用可区分的菌落计算稀释液中所有斑点的菌落总数，并使用该值计算每个实验中使用的实际接种剂量。不要简单地依赖 OD600 值。
  3. 将UTI89kanR 接种到麻醉的雌性小鼠的膀胱中（第0天）
    注：该程序的录像已在44，46之前公布。有关更全面的说明，请参阅这些论文。有关小鼠导管插入术的更多详细信息，请参阅本方案的第5节。
    1. 根据IACUC批准的方法用异氟醚吸入麻醉小鼠。
    2. 在等待小鼠麻醉时，用UTI89kanR 接种物填充结核菌素注射器，然后贴上准备好的导管。按下柱塞使导管中的空气排出，然后将导管轻拍到无菌手术润滑剂中。
    3. 将鼠标放在背面，通过用力挤压鼠标脚垫并观察没有反射或反应来确认麻醉。将膀胱（感觉像豌豆在下腹部）放在每只手的食指之间。通过向对方移动手指来表达尿液，以对膀胱施加轻柔的挤压压力。
    4. 将导管通过小鼠尿道插入膀胱，缓慢输送50μL接种物。
    5. 等待几秒钟，然后直接拔出导管，轻轻取出导管。将鼠标放回笼子并监测，直到它从麻醉中恢复。
    6. 用其他小鼠重复步骤1.3.1 - 1.3.5，在每个笼子（5只小鼠）之间更换导管。如果需要，可以使用相同的程序来接种PBS的对照组小鼠，例如显示阴道 G .的另一株引起rUTI（在自发/背景水平上）。

2. 监测 UPEC 菌尿的清除情况（第 1 至 28 天）

注意：尿液收集程序的视频之前已于44发布。

  1. 通过膀胱触诊从所有小鼠收集尿液（至少10μL），如感染后1 d和每周4 周（感染后7，14，21和28 d）所述44。尿液应在收集后几小时内进行培养，以监测 UPEC 感染。将尿液储存在4°C直至镀液。尿液也可用于细胞学检查（见第4节）。偶尔如果膀胱发炎，则无法获得10μL尿液;在这种情况下，PBS可以加入高达10μL，但必须相应地调整尿细菌滴度和细胞学评分（例如，如果仅收集5μL尿液并加入5μL PBS，则将滴度和评分乘以2）。
  2. 使用多通道移液器，在96孔板中的无菌PBS中将1：10连续稀释至10-6 。使用P10多通道移液器在含有相关抗生素选择标记物的LB板左边缘的垂直方向从色谱柱1中分离出10μL所有6种稀释液。丢弃吸头。
  3. 对剩余的样品（列2，然后是列3等）重复电镀。单板可并排容纳 5 个样品。这会产生一个具有5×6点基质的板，从上到下稀释度增加，样品数量从左到右增加（图2A）。
  4. 让斑点在台面上干燥，然后在37°C下孵育过夜。第二天，计算菌落不同的最不稀释点的菌落数量（图2B），并使用此数字计算CFU / mL：
    单尿斑中菌落数×稀释因子 × 100 = CFU/mL 尿液
  5. 使用绘图软件绘制UTI89kanR 尿滴度（图2C）。在28天时识别尿液中没有可检测到的UTI89kanR 的小鼠（〜65-80%的C57BL / 6小鼠）。这些小鼠携带静止的细胞内储层，并在随后的实验阶段用于检查复发性UTI的诱导。那些在28天时尿液中有细菌的人不包括在随后的步骤中。

3. 膀胱暴露于 阴道毛滴虫

  1. 将小鼠分配到暴露组（第29天）。此步骤的主要目标是避免将所有具有更长时间的菌尿的小鼠放在同一暴露组中，因为尚不清楚这是否会影响rUTI的可能性。
    1. 使用尿液CFU数据（图2D），根据UTI89kanR 菌尿不再可检测到的时间点对小鼠进行分类（图2E）。
    2. 将每个类别的小鼠随机分配到 阴道毛孢杆菌 或PBS接种组;例如，在第7天之前清除的小鼠中有一半获得 阴道G ，一半将获得PBS;在第8天和第14天之间清除的小鼠的一半将获得 阴道G ，一半将获得PBS等（如图 2E所示）。
  2. 准备 阴道接 种物（所有步骤在厌氧室中进行）
    注意：理想的培养孵育时间因 阴道芽孢杆菌的不同菌株而异，一些菌株进入静止期，甚至开始比其他菌株更快地死亡。鉴于杀死 的阴道G. （JCP8151B）无法触发rUTI39，这一点尤其重要。因此，在小鼠中进行实验之前，应根据经验确定给定菌株的孵育时间。目前尚不清楚其他/所有 阴道毛果体 菌株是否会在此模型中引发相同的效果。
    1. 条纹 G.阴道 从-80°C冷冻储备品到NYCIII板（无抗生素）上。将板在37°C厌氧下孵育24小时。
    2. 在厌氧室中，从NYCIII板中接种5mL具有1μL环状细胞（单个菌落不足）的厌氧NYCIII培养基，并在厌氧条件下在37°C下静态孵育18小时。不要在生长培养基中加入抗生素。
  3. 使用分光光度计测定培养物的OD600 。
    1. 将规定体积（X）的培养物以9600× g 离心1分钟并吸出培养基。使用以下等式计算PBS的体积（Y）以重新悬浮沉淀以达到所需的接种物OD，以在50μL内达到108 CFU：
      X mL × OD培养 物 = Y mL × OD接种物 求解 Y
      Y = （X 毫升 × OD培养物） / OD接种物
      注意：JCP8151BSmR 的外径接种物为 5，但对于其他阴道芽孢杆菌菌株，必须根据经验确定。例如，如果纺丝3毫升JCP8151BSmR过夜液体培养物，OD培养物= 2.0：Y = （3毫升×2.0）/ 5.0;因此，将沉淀重悬于 1.2 mL PBS 中
    2. 将PBS中的细菌沉淀重悬至所需浓度。连续稀释并接种接种物（如上面的CFU电镀方案中所述），以确定每个实验中使用的实际接种物剂量。不要仅仅依赖 OD 值。
  4. 在UPEC接种后的第29-31天，按照上述步骤1.3所述，用 阴道G 或PBS接种麻醉的小鼠。PBS对照组是必不可少的，因为导尿膀胱的行为可能会诱发损伤和尿路上皮剥脱，从而引起一定程度的UPEC储液囊再出现。 因此，PBS接种小鼠作为与阴道接种 小鼠进行比较的对照。
    注意：在28 d下最终的UPEC菌尿测定需要CFU板孵育过夜。因此，此步骤最早可以在初始UPEC接种后的29天进行。如有必要，暴露可以最晚在第31天进行。研究人员应该在实验之间保持一致。
  5. 重复接种制剂以在所需时间点（例如第一次接种后12小时或1周）进行第二次 阴道G. （或PBS对照）接种。第二次暴露是必要的，因为单次接种 阴道球菌 不会导致显着的UPEC出现39。

4. 监测复发性尿路感染

  1. 在每次 阴道假单胞菌 接种后的所需时间点收集小鼠的尿液（推荐接种后1，2和3 d）。
    1. 在选择性平板（例如 LB+卡那霉素）上连续稀释和平板尿液，以确定 UTI89卡纳尔 CFU/mL。如果需要，尿液稀释液也可以接种在选择性平板上（例如，NYCIII + 1 mg/mL 链霉素）以确定阴道 GFU/mL。然而，阴道G.JCP8151BSmR在12小时39时从大多数小鼠的尿液中清除。 因此，在大多数小鼠中，需要更早的时间点来检测阴道G.
  2. 在实验终点（例如，在第二次 阴道G 接种后3天），根据批准的方法（例如，异氟醚麻醉下的宫颈脱位或CO2 吸入下）处死小鼠并收集膀胱和肾脏用于CFU计数，如前所述 44，46。

5. 尿液细胞学检查

注意：该过程可以在需要可视化尿液中存在的细胞和/或细菌的任何时间点进行。如图 1所示，尿细胞学检查通常在1 dpi（甚至更早）下进行，以检查急性UPEC感染，并在3期期间评估尿液中显示UPEC出现的多形核（PMN）细胞的存在。

  1. 将10μL尿液加入90μLPBS中，在带有附加过滤器和载玻片的细胞分裂盒中。（最简单的方法是使用用于尿液培养的96孔板中剩余的1：10稀释液，如果储存在4°C，这些样品可以在尿液培养后24小时使用）。将盒放入细胞离心机中，并以600-800 ×g 的速度旋转6分钟，加速度高。
  2. 取出载玻片，让其干燥过夜。第二天，根据制造商的方案，使用血液学染色试剂盒（例如赖特氏，Giemsa，包括固定剂）进行染色。
  3. 通过光学显微镜分析载玻片是否存在PMN和上皮细胞。如果需要，可以使用定性评分指标对它们进行评分，该指标基于每个高倍视野中存在的每种细胞类型的丰度（例如，0=无，1=少数，2=中等，3=稳健）。确保分析载玻片的个体对实验组视而不见，以最大限度地减少潜在的偏差。

6. 通过扫描电子显微镜对膀胱进行成像

注意：该过程可以在需要尿路上皮可视化的任何时间点进行。 如图1 所示（紫色框），在储库形成阶段UPEC接种后6小时至24小时之间最好地可视化UPEC与尿路上皮相互作用，并且由 阴道芽孢 杆菌引发的尿路上皮剥落在第二次 阴道G .暴露后的3小时至12小时内最好可视化。

  1. 膀胱原位固定
    1. 在膀胱收获前立即通过在pH 7.4下向0.15M二甲酸钠缓冲液中加入戊二醛（2.5%最终）和多聚甲醛（2 %最终）来制备固定剂。使用来自新打开的玻璃安瓿的多聚甲醛和戊二醛，因为这两种固定剂在打开的容器中都会随着时间的推移而氧化。
      注意：戊二醛有毒，呼吸道刺激性和腐蚀性;多聚甲醛易燃，致癌，刺激性和生殖毒素;二甲砷酸钠是有毒和致癌的。
    2. 要制成50 mL固定剂溶液，在pH 7.4和4 mMCaCl 2下，加入6.25 mL 16%多聚甲醛，2 mL 50%戊二醛和16.75 mL超纯水加入25 mL的0.3 M卡考代酸钠溶液中。
    3. 在施用膀胱之前将准备好的固定剂加热至37°C。
    4. 用固定剂填充结核菌素滑头注射器，并将导管固定到末端，斜面朝向相反的注射器标记。从针头末端剪掉多余的管子1-2毫米，注意不要暴露针尖。轻拂注射器以除去气泡，并将柱塞推至空空空气，并在微量离心管上用固定剂填充导管，以收集任何固定剂以进行适当处置。
    5. 使用批准的方法麻醉并处死小鼠（例如，麻醉下的颈椎脱位）。将鼠标放在解剖表面上，固定腿（用橡皮筋或针）。用镊子和一把手术剪刀打开小鼠骨盆区域以暴露膀胱。小心地将相邻的脂肪推到一边，但将膀胱留在原位。
    6. 用惯用手握住注射器，针头朝下，针头斜面和注射器标记朝向你。将导管尖端浸入无菌润滑剂中。
    7. 将导管尖端放在尿道开口处，将注射器管保持在小鼠身体上30-45°角的位置。
    8. 使用尖端的非常小的顺时针运动向下施加压力，然后将导管轻轻插入尿道。当导管尖端进入尿道时，将注射器铰接到小鼠尾巴，同时继续将导管进一步滑入尿道，直到注射器枪管与工作表面平行。整个导管针轴（不包括底座）应进入小鼠体内，将导管尖端定位在膀胱腔内。
    9. 缓慢输送50-80μL固定剂，使膀胱像气球一样膨胀。将导管保持在适当的位置，并稍微抬起注射器，使尖端向上倾斜。
    10. 用另一只手，打开止血器，在尿道交叉处的导管针下滑动一个插脚。部分关闭止血器，直到它与针头接触。
    11. 轻轻地将导管针从膀胱中滑出，同时完全夹紧并锁定止血器，以防止固定剂丢失。
    12. 握住止血器，使其与工作表面平行，膀胱位于顶部。轻轻抬起，小心地切开止血器下方（膀胱的另一侧），以取出仍然附着的止血剂的膀胱。
    13. 将膀胱和附着的止血剂放入含有温热固定剂的Falcon管中。确保气囊完全浸没在液体中，而不是压在管壁上。在4°C下孵育24小时。
  2. 使用扫描电子显微镜（SEM）进行膀胱处理和成像
    1. 用清洁的双面剃须刀片将膀胱钝化，并与止血剂切向第二次切口以释放膀胱。这导致2个半膀胱“杯子”。如果膀胱外部有任何残留的脂肪垫，请轻轻地将其取出。
    2. 在卡甲代酸钠缓冲液（0.15M，pH 7.4）中冲洗膀胱三次（每次10分钟）。
    3. 在室温下用1%四氧化二锇在0.15M卡考代酸缓冲液中染色组织1小时。锇对光敏感;因此，将染色容器包裹在箔中以维持黑暗环境来执行此步骤。
      注意：四氧化二锇有毒，对皮肤有腐蚀性。戴着手套在通风橱中执行此步骤。
    4. 用超纯水冲洗膀胱一半三次（每次10分钟）。在这些步骤中，有时可以在水面上看到渗透油。吸气或吸出，以防止在干燥步骤中受到污染。
    5. 通过将组织浸没在分级乙醇系列（50，70，90，100和100%）中脱水10分钟。
    6. 使用临界点干燥机以最慢的速度进行12次CO2 交换，干燥固定的组织。将所有其他设置设置为慢速，但通风步骤设置为“快速”除外。
    7. 用干净的双面剃须刀再次将每个膀胱的一半一分为二，以产生总共4个碎片，以减少标本的曲率，从而更有效地进行涂层，便于在SEM中成像，并暴露干燥期间可能卷曲的组织。
    8. 将气囊片粘附在铝制短桩上的导电碳粘剂卡舌上，并在与牙签接触的底部周围涂上少量的银胶，注意防止多余的胶粘剂芯渗到气囊内表面。
    9. 使用高真空溅射镀膜机溅射涂有6nm铱的样品残端。如果样品继续充电，请确保用银漆将导电路径涂在表面上，并涂上额外的4nm铱。
    10. 用扫描电子显微镜对样品进行成像。虽然条件可能因所使用的显微镜而异，但当使用埃弗哈特- 索恩利（SE2）电子探测器时，在蔡司Merlin FE-SEM上，3 KeV的加速电压和200 pA的光束电流和12-13 mm的工作距离在蔡司梅林FE-SEM上效果很好。

Representative Results

接种后，尿液中可检测到UPEC滴度（图2B）。未能在含有卡那霉素的选择性培养基上接种尿液样本可能会导致污染尿液的内源性小鼠微生物群过度生长。UPEC菌尿水平在第1天可能很高，并且可能在第一周内增加，然后在稍后的时间点降低（图2C）。大约65-80%的小鼠在28 dpi的尿液中没有可检测到的UPEC（图2C，绿色圆圈）。这些鼠标可以在模型的后续步骤中使用。保持细菌的小鼠（图2C，红色椭圆）应从实验中消除。

阴道 G. 的 两次连续暴露间隔 12 小时（图 3A）或间隔 1 周（图 3B）导致细胞内储库出现 UPEC，导致复发性菌尿。与PBS对照组相比，暴露于 阴道G 的小鼠中UPEC菌尿水平（曼惠特尼试验）和显示UPEC rUTI的小鼠比例（费舍尔精确测试）显着更高。尿液细胞学分析检测来自阴道暴露的 G.小鼠尿液中的PMN，这些小鼠显示UPEC出现（图3C）。在间隔1周的两次暴露的模型中，与PBS相比，阴道暴露的 G.小鼠膀胱组织中的UPEC滴度较低（图3D），可能是由于UPEC从储库和随后的清除中出现。

通过SEM对原位固定膀胱组织的可视化显示，仅暴露于PBS的对照小鼠的膀胱表面排列的大浅表伞形尿路上皮细胞（图4A）。尿路上皮去角质的证据是浅表伞状细胞的丧失，揭示了暴露于 阴道芽孢杆菌 的小鼠中较小的潜在下移行上皮细胞（图4B）。在UPEC接种后的早期，在细胞内储库建立期间，UPEC在尿路上可见，并且从去角质细胞中长出细丝（图4C）。

Figure 2
图 2.在第1阶段（储库形成）期间监测尿液中的UPEC滴度。 （A） 菌落形成单元（CFU）电镀示意图。（B）尿中UPEC滴度的LB + 卡纳霉素的代表性图像。黑色圆圈表示尿液样本斑点，应进行计数以计算 CFU/mL。（C）C57BL / 6小鼠中细菌尿的时间过程。每条线代表一只小鼠，追踪UPEC尿液滴度随时间的变化。虚线表示检测限 （1000 CFU/mL）。红色椭圆表示四只小鼠（共20只）未能解决UPEC菌尿，因此不会用于 阴道G.诱导的rUTI模型。相反，绿色圆圈表示小鼠解决了UPEC菌尿并进入后续阶段。（D） 用于生成图的数据表 C. 黄色、可检测的CFU;绿色，无丙氧丙酸。（E）根据尿液中不再检测到UPEC CFU的时间点将小鼠随机分配到暴露组（“解决日”）。面板 D 左列中的鼠标编号与面板 E 中给出的鼠标编号相同， 请单击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3. 阴道 G. 触发 UPEC 鲁蒂。 UPEC在两次连续尿路暴露于PBS（圆圈）或 阴道G .（格宏体;方块）后，尿液中的滴度为12小时（A）或1周（B）。每个符号代表一个单独的鼠标。绘制第二次暴露后1-3天之间从每只小鼠检测到的最高CFU / mL UPEC。在没有可检测菌尿的小鼠绘制在检测极限处（虚线）。（C）尿液细胞学分析显示UPEC（箭头）和多形核（PMN）细胞（箭头）。比例尺 = 20 μm。（D）膀胱组织中的UPEC滴度在两次连续尿路暴露后收集3 d，间隔1周。每个符号代表不同的鼠标，零在检测极限处绘制（虚线）。在 A、B 和 D 中，箱子位于第一和第三个四分位数处，其中中位数标记，晶须从最小到 最大 <。 ** P < 0.01; P < 0.0001。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4.原位固定膀胱的扫描电镜分析。 在两次暴露于PBS（A）或 阴道G （C）后3小时（间隔12小时）从小鼠收集膀胱。虚线表示单个尿上皮细胞，该细胞在阴道暴露的 膀胱中较小，因为大的浅表细胞已经脱落，露出潜在的过渡上皮。（B）在模型第1阶段首次接种UPEC后6小时收集膀胱，显示尿路上皮去角质和细胞外UPEC。（D）膀胱表面存在的不溶性脂肪滴的例子。比例尺在主图像中为20 μm，在插图中为2 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

该模型中的第一个关键步骤是鉴定在原发性UTI阶段尚未清除UPEC菌尿的小鼠。这些小鼠必须从实验中取出，否则它们会混淆 阴道G. 暴露后UPEC菌尿的发生率。初始 UPEC 接种后，应每周收集尿液以监测细菌清除率。大约65-80%的C57BL / 6小鼠将在4周内清除UTI89kanR 感染。其他自交小鼠品系对UPEC间隙42，43 和储层形成具有不同的倾向，因此可能不适合该模型。第二个关键点是，实证研究已经确定， 阴道毛滴虫 的两次连续接种（间隔12小时或1周）对于触发仅在暴露于PBS的对照小鼠中发生的背景自发出现之上的显着储库出现是必要的。两个连续暴露之间的其他持续时间尚未测试，但可能会产生类似的结果。重要的是要注意，仅在 阴道毛孢 杆菌暴露1周的模型中观察到UPEC膀胱滴度的降低39。虽然可以进行两次以上的暴露，但经验证据表明，仅重复导尿就会增加出苗，这可能会混淆对结果的解释，或者需要更多的动物来区分暴露组和对照组之间的差异。最后，原位膀胱固定方法有几个关键步骤。需要一些技能来确保固定剂保持在夹紧的膀胱内。放气的膀胱将更难通过SEM成像。将固定剂接种到膀胱中时，非常温和也很重要，因为用含固定剂的导管刮擦尿路上皮可以诱导尿路上皮去角质，而与 阴道球菌引发的是什么无关。固定剂鸡尾酒中提到的所有浓度都是最终浓度。这些比例不当会导致细胞的固定和肿胀或收缩不足。固定剂应加热至生理温度，以避免细胞和组织的温度冲击。变暖还略微改善了固定剂通过质膜的扩散速率。虽然对于制备用于SEM分析的样品，通常可以省略锇染色，但这是该方案中稳定脂质并防止细胞膜在临界点干燥期间开裂的重要步骤。

可以修改该协议以分别测试其他UPEC和/或 阴道芽孢杆菌 菌株形成储库和触发其出现的能力。还可以添加其它实验因素，例如暴露于其它阴道细菌（例如， 透明乳杆菌 PVAS100）或热杀伤 的阴道G.，这两者在该模型39中均未表现出病理学。在选择其他细菌菌株进行测试时，重要的是要证明生长一致，以便在所有实验中使用标准接种物浓度。JCP8151BSmR 的生长已在厌氧室中进行了优化。该菌株可能在厌氧GasPak系统中培养，但这需要优化以确保强大的细菌生长。最后，可以修改模型中某些步骤的时间。例如，可以在UPEC储层形成阶段的早期时间点收集尿液，以监测CFU或宿主反应。在该模型中未观察到在早期时间点（3，6，12 hpi）收集尿液样本对感染进展或建立储库的不利影响。据报道，UPEC储层的出现发生在给予两次JCP8151BSmR 剂量12小时或1周后，但其他时间间隔尚未测试。也可以通过将UPEC储库形成阶段减少到2周（而不是4周）来减少模型的总时间长度，因为许多小鼠此时已经清除了菌尿。先前检查膀胱暴露于化学去角质剂后UPEC出现的研究使用了1或2周的UPEC储层形成阶段17，18。然而，减少UPEC菌尿清除的时间可能是以需要从实验中剔除更多动物为代价的。最后，可以在其他时间点进行膀胱的SEM分析，以观察 阴道G. 对尿路上皮的影响的持续时间。

关于故障排除，有一些重要的考虑因素，特别是关于膀胱SEM分析。根据所使用的小鼠背景和炎症的程度，一些膀胱会出现非常薄的壁。这些膀胱在临界点干燥期间往往会卷曲更多，并可能导致类似壳的形状。如果发生这种情况，最好的方法是沿着卷曲的界面将壳状膀胱切成两半，然后第二次去除大部分悬垂组织。使用PTFE涂层的双刃剃须刀片进行切割效果最佳。多余的脂肪有时会在锇染色步骤中溶解。这可能导致不需要的不溶性脂肪飞沫，在冲洗和脱水步骤中可能无法洗掉，并且在随后的干燥过程中可能会沉降在膀胱表面。这些液滴可以表现为散布在样品上的小球体或圆盘状结构（图4D）。这可以通过确保从膀胱周围去除尽可能多的脂肪组织来缓解。铂可以代替铱涂层，但厚度应保持在最低限度，以减少对精细结构细节的遮蔽。强烈建议在涂装过程中使用旋转平台。

该模型的一个局限性是它需要大量的小鼠。只有65-80%的C57BL / 6小鼠会清除其UPEC菌尿，并适合随后的 阴道G. 或PBS接种（见 图2C）。为了每组获得10-12只小鼠（阴道接种G. 与PBS），应首先感染约30只小鼠UPEC。此外，可能需要多次实验才能实现检测统计显著性所需的生物学重复。当暴露间隔1周时，UPEC出现在暴露于PBS的14%的小鼠中（图3B）。因此，检测 阴道假单胞菌 暴露小鼠中相对于PBS对照组（功率为0.8; α = 0.05 [单侧]）的UPEC rUTI显着增加需要测试每个暴露组的累积总数至少40只小鼠。另一个考虑因素是，这些实验是昂贵和劳动密集型的。必须每周监测小鼠的UPEC清除率，实验时间过程为4-5周，具体取决于 阴道G. 是在12小时的时间内给予两次还是间隔两次1周。SEM是劳动密集型的，并且可能很昂贵，具体取决于显微镜的可用性和服务费。为SEM准备整个气囊为分析提供了丰富的材料，但缺点是分析每个气囊可能非常耗时。因此，与用于尿液和组织滴度的较高动物数量相比，SEM可能只能分析有限数量的膀胱。此外，获得膀胱“杯子”弯曲表面的高质量图像需要技能，因为阴影会阻碍能见度。虽然膀胱扫描电镜检查是可视化尿路上皮去角质的有用工具，但这种方法在很大程度上是定性的。由于样品固定在圆形，并且由于在固定剂中使用戊二醛，因此无法通过光学显微镜筛选荧光表达的细菌。免疫染色和化学染料与该过程不相容，因为使用戊二醛会交联大多数抗原和锇，并且会掩盖抗原位点并使组织变暗。也就是说，SEM技术对于无需使用其他探针即可定量评估的参数非常有用，例如细胞大小48，49。

此模型提供了除前面描述的方法之外的几个优点。它允许检查由膀胱储液器出现引起的UPEC rUTI的机制，而不是从外部来源重新引入膀胱。由于膀胱储液器出现的rUTI的其他模型使用化学试剂（硫酸鱼精蛋白或壳聚糖）引起尿路上皮去角质17，18，这不会是女性rUTI的触发因素。 阴道假单胞菌 是一种流行的泌尿生殖系统细菌，在一些女性中，通过导管插入术或耻骨弓上抽吸直接从膀胱收集的尿液中检测到23，26.这一事实，加上BV（ 阴道毛果在阴道 中过度生长）与UTI之间的已知关联，表明 阴道毛滴虫 是rUTI的临床上合理的触发因素。最后，原位膀胱固定方法保留了膀胱超微结构并限制了损伤，确保膀胱层不会彼此分离。以前用于可视化尿路上皮的方法传统上是让用户无菌地收获，一分为二，拉伸并将膀胱固定在解剖盘上，然后将拉伸的膀胱浸入固定剂48中。这种方法产生非常平坦的样品，但不能确保组织的均匀或自然拉伸，并且可能导致过度和不足的区域拉伸（导致高度褶皱的组织），并可能导致膀胱层分离。此外，这些对膀胱的物理操作以拉伸和固定组织会导致损伤，包括尿路上皮去角质。另一种方法是将完整的膀胱浸没在固定剂中，然后包埋在石蜡中并用切片机获取薄片。薄切片对于检查细菌和宿主蛋白定位的免疫组织化学实验非常有价值，但薄切片不允许尿路上皮表面的可视化。这种SEM方法允许一次检查整个膀胱的表面。

如前所述，该模型的未来应用包括测试其他UPEC菌株以确定它们是否形成细胞内储库，并测试其他 阴道芽孢杆菌 菌株以评估它们是否引起角质和UPEC出现导致rUTI。C57BL / 6小鼠以外的其他小鼠菌株也可以进行测试，尽管不建议使用具有高发展慢性膀胱炎倾向的小鼠（例如C3H背景上的小鼠），因为需要从实验中剔除太多的小鼠。C57BL / 6小鼠的另一个优点是许多基因敲除菌株是市售的。这种菌株为询问储层形成和/或出现所涉及的宿主因素提供了机会。

Disclosures

作者声明他们没有与本研究相关的利益冲突。

Acknowledgments

作者感谢林恩·福斯特在感染实验中的技术援助，华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI）的詹姆斯·菲茨帕特里克访问SEM，斯科特·胡尔特格伦负责UTI89kanR UPEC菌株，大卫·亨斯塔德对手稿进行了批判性阅读。

这项工作得到了美国国家科学基金会（VPO#DGE - 1143954研究生研究奖学金），华盛顿大学医学院妇女传染病研究中心（NMG试点研究奖），美国心脏协会：#12POST12050583（NMG）和#14POST20020011（NMG）以及美国国立卫生研究院NIAID：R01 AI114635（ALL）和NIDDK的支持： R21 DK092586 （ALL）、P50 DK064540-11 （SJH， 项目 II PI：ALL） 和 K01 DK110225-01A1 （NMG）。一些动物研究是在NCRR拨款C06 RR015502支持的设施中进行的。华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI，SEM在那里进行）和MSJ得到了华盛顿大学医学院，华盛顿大学儿童发现研究所和圣路易斯儿童医院（CDI-CORE-2015-505），巴恩斯犹太医院基金会（3770）和国家神经疾病和中风研究所（NS086741）的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

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由<em>加德纳菌阴道</em>膀胱暴露在小鼠中引发的复发性<em>大肠杆菌</em>尿路感染
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