En musmodell av uropatogen E. coli (UPEC) transuretral ympning för att etablera latenta intracellulära blåsreservoarer och efterföljande blåsexponering för G. vaginalis för att inducera återkommande UPEC UTI visas. Det demonstreras också uppräkning av bakterier, urincytologi och in situ-blåsfixering och bearbetning för svepelektronmikroskopi.
Återkommande urinvägsinfektioner (rUTI) orsakade av uropatogen Escherichia coli (UPEC) är vanliga och kostsamma. Tidigare artiklar som beskriver modeller av UVI hos han- och honmöss har illustrerat procedurerna för bakteriell ympning och uppräkning i urin och vävnader. Under en initial urinvägsinfektion hos C57BL/6-möss etablerar UPEC latenta reservoarer inuti blåstepitelceller som kvarstår efter clearance av UPEC-bakteriuri. Denna modell bygger på dessa studier för att undersöka rUTI orsakad av uppkomsten av UPEC inifrån latenta blåsreservoarer. Den urogenitala bakterien Gardnerella vaginalis används som utlösare av rUTI i denna modell eftersom den ofta förekommer i kvinnors urogenitala kanaler, särskilt i samband med vaginal dysbios som har associerats med UTI. Dessutom beskrivs en metod för in situ-blåsfixering följt av svepelektronmikroskopi (SEM) -analys av blåsvävnad, med potentiell tillämpning på andra studier som involverar urinblåsan.
Urinvägsinfektioner (UTI) innebär en betydande sjukvårdsbörda över hela världen och påverkar livskvaliteten för miljontals människor varje år, särskilt kvinnor1. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) är den vanligaste orsaken till UTI1. Många patienter (cirka 20-30%) som utvecklar UTI kommer att uppleva en återkommande UTI (rUTI) inom 6 månader trots antibiotikamedierad clearance av den initiala infektionen2. Tyvärr lider så många som 5% av premenopausala kvinnor av 3 eller fler rUTI varje år 3,4. Sekventiella episoder av rUTI kan orsakas av persistens av samma UPEC-stam från indexfallet 5,6,7,8. Data från mänskliga prover och musmodeller tyder på att rUTI med samma stam kan orsakas av UPEC som bor i vilande reservoarer i urinblåsan. Hos människa påvisades UPEC i epitelceller och blåsbiopsier hos patienter med UTI 9,10,11,12,13. Studier på C57BL/6-möss har visat att vissa stammar av UPEC kan etablera vilande intracellulära reservoarer i urinblåsan, vilket detekteras genom fluorescensmikroskopi och genom homogenisering och odling av blåsvävnad, som bibehålls i månader efter upplösning av bakteriuri 14,15,16. Behandling av urinblåsan med medel som inducerar exfoliering av blåsepitelet (urotel), t.ex. protaminsulfat17 eller kitosan18, utlöser uppkomsten av UPEC från reservoarer för att orsaka rUTI. Dessa data tyder på att hos kvinnor som hyser UPEC-reservoarer från en tidigare infektion kan exponeringar för urinblåsan som leder till urotelial exfoliering utlösa rUTI.
Det finns allt fler bevis för att den vaginala mikrobiotan bidrar till urinvägsinfektion19,20. Gardnerella vaginalis är en frekvent medlem av både vaginal och urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I slidan är närvaron av höga nivåer av G. vaginalis associerad med en mikrobiell dysbios som kallas bakteriell vaginos (BV), som drabbar ~ 30% av kvinnorna 30,31,32. Kvinnor med BV löper en högre risk att uppleva UVI jämfört med kvinnor med en vaginal gemenskap domineras av Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musmodeller orsakar G. vaginalis epitelial exfoliering både i slidan38 och i urinblåsan39. I C57BL/6-möss som hyser UPEC-blåsreservoarer resulterar två sekventiella blåsexponeringar för G. vaginalis – men inte för PBS – i återuppkomst av UPEC från reservoarer för att orsaka UPEC rUTI. Uppkomsten framgår av uppkomsten av UPEC-titrar i urinen från möss som tidigare hade löst UPEC-bakteriuri och en efterföljande minskning av UPEC-blåshomogenattitrar vid avlivning jämfört med PBS-exponerade kontrolldjur39. Intressant nog finns det inte en varaktig kolonisering av G. vaginalis i urinblåsan. I de allra flesta fall är två korta exponeringar, var och en med mindre än 12 (h) livskraftig G. vaginalis i urinen, tillräckliga för att framkalla urotelial exfoliering och främja rUTI.
Detta protokoll beskriver en musmodell av rUTI orsakad av UPEC som bor i intracellulära blåsreservoarer, med användning av G. vaginalis blåsinokulering för att utlösa återfall. Framstegen som uppnås med denna modell är att G. vaginalis är en kliniskt relevant biologisk utlösare av rUTI jämfört med tidigare använda kemiska medel. Vidare möjliggör den relativt kortlivade överlevnaden av G. vaginalis i musens urinvägar undersökning av effekterna av övergående mikrobiella exponeringar på urotel, vilket kan inträffa efter sexuell aktivitet. Förutom att beskriva rUTI-modellen beskriver detta protokoll också metoder för urincytologi och in situ-urinblåsfixering och avbildning av urotelet genom svepelektronmikroskopi (SEM).
Detta protokoll för G. vaginalis-inducerad återkommande UPEC UTI använder UPEC-stam UTI89 med en kanamycinresistenskassett (UTI89kanR)40. Inte alla stammar av UPEC som testades kunde bilda intracellulära bakteriesamhällen under det akuta infektionsstadiet hos möss41 och det är ännu inte känt om alla stammar av UPEC har förmågan att bilda latenta intracellulära reservoarer. Reservoarbildning bör bekräftas före användning av andra UPEC-stammar i modellen. Detta protokoll använder ett spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induktion av rUTI av JCP8151BSmR kräver två sekventiella G. vaginalis-inokuleringar , givet antingen 12 timmar eller 7 dagar (d) med39 mellanrum. Huruvida andra G. vaginalis-stammar inducerar exfoliering och/eller UPEC rUTI återstår att bestämma med denna modell. Det är viktigt att använda UPEC- och G. vaginalis-stammar med känd antibiotikaresistens (såsom kanamycin eller spektinomycin för UPEC och streptomycin för G. vaginalis) eftersom antibiotika kan läggas till agarplattor för att förhindra tillväxt av endogen musmikrobiota som annars kan störa uppräkningen av kolonibildande enheter (CFU) för att övervaka infektion. Detta är särskilt viktigt för odling av urinprover, eftersom musurin ofta innehåller andra bakterier som kan växa över på odlingsplattor utan antibiotika. Ursprunget till dessa endogena bakterier i musurin är okänt men återspeglar sannolikt periuretrala och urogenitala bakterier som plockas upp under urinuppsamlingen.
G. vaginalis är en fakultativ anaerob bakterie och därför beskriver detta protokoll växande G. vaginalis JCP8151BSmR i en anaerob kammare. Om en anaerob kammare inte är tillgänglig kan andra metoder för att upprätthålla anaeroba tillväxtförhållanden (t.ex. en GasPak-påse i en lufttät behållare) användas. Alternativt kommer vissa stammar av G. vaginalis (inklusive JCP8151BSmR) att växa i en standard vävnadsodlingsinkubator (5% CO2). Precis som användning av andra G. vaginalis-stammar än JCP8151BSmR kräver testning för att säkerställa att bakterierna beter sig på samma sätt i denna modell, kräver förändrade tillväxtförhållanden empirisk bestämning av ideala varaktigheter för odling (på plattor och i vätska) och optisk densitet (OD) 600 ekvivalenter för att uppnå önskade livskraftiga inokulumkoncentrationer. Dessutom är det inte känt om tillväxtförhållanden påverkar patobiologin hos G. vaginalis.
Slutligen, när man överväger om man ska använda denna modell, bör forskare vara medvetna om att det kan kräva ett större antal djur per grupp än typiska UTI-musmodeller. Detta beror delvis på att induktion av rUTI kräver att mössen löser UPEC-bakteriuri som orsakas av den initiala infektionen i urinblåsan. Således ingår inte någon mus som misslyckas med att rensa bakteriuri (en fenotyp som vanligtvis indikerar pågående njurinfektion) i rUTI-fasen av protokollet. Antalet möss som behövs för att driva dessa studier påverkas också av graden av “spontan” UPEC-uppkomst i urinen (12-14% i genomsnitt). Slutligen har olika musstammar olika benägenheter att utveckla kronisk bakteriuri kontra intracellulär reservoarbildning42,43. Om andra musstammar än C57BL/6 används i denna modell måste det bekräftas att djuren utvecklar vilande UPEC intracellulära reservoarer.
Det första kritiska steget i denna modell för att identifiera möss som inte har rensat UPEC-bakteriuri under den primära UTI-fasen. Dessa möss måste tas bort från experimentet eftersom de annars skulle förvirra hastigheten på UPEC-bakteriuri efter G. vaginalis exponering. Efter den första UPEC-ympningen bör urin samlas in varje vecka för att övervaka bakteriell clearance. Cirka 65-80% av C57BL / 6-möss kommer att rensa en UTI89kanR-infektion inom 4 veckor. Andra inavlade musstammar har olika benägenhet för UPEC-clearance42,43 och reservoarbildning och är därför kanske inte lämpliga för denna modell. Den andra kritiska punkten är att empiriska studier har fastställt att två sekventiella inokuleringar av G. vaginalis (antingen 12 h eller 1 wk från varandra) är nödvändiga för att utlösa signifikant reservoaruppkomst ovanför bakgrunden spontan uppkomst som uppträder hos kontrollmöss som endast utsätts för PBS. Andra tidsperioder mellan de två sekventiella exponeringarna har inte testats men kan ge liknande resultat. Det är viktigt att notera att en minskning av UPEC-blåstiter endast observerades i modellen där G. vaginalis-exponeringar gavs 1 wk isär39. Även om mer än två exponeringar kan administreras, tyder empiriska bevis på att upprepad kateterisering ensam ökar uppkomsten, vilket kan förvirra tolkningen av resultaten eller kräva ett större antal djur för att skilja skillnader mellan exponeringsgrupper och kontroller. Slutligen har in situ-blåsfixeringsmetoden flera kritiska steg. Viss skicklighet krävs för att säkerställa att fixeringsmedlet förblir inuti de klämda blåsorna. Tömda blåsor blir svårare att avbilda med SEM. Det är också viktigt att vara mycket försiktig när man ympar fixeringsmedlet i urinblåsan, eftersom skrapning av urotelium med den fixativinnehållande katetern kan inducera urotelial exfoliering oberoende av vad som utlöses av G. vaginalis. Alla koncentrationer som nämns i den fixativa cocktailen är slutliga koncentrationer. Felaktiga förhållanden av dessa kan resultera i otillräcklig fixering och svullnad eller krympning av cellerna. Fixeringsmedel bör värmas till fysiologiska temperaturer för att undvika temperaturchock i celler och vävnader. Uppvärmning ger också en liten förbättring av diffusionshastigheten för fixeringsmedel genom plasmamembran. Medan osmiumfärgning ofta kan utelämnas för prover som är förberedda för SEM-analys, är det ett viktigt steg i detta protokoll för att stabilisera lipider och förhindra sprickbildning av cellulära membran under kritisk punkttorkning.
Detta protokoll kan modifieras för att testa andra UPEC- och / eller G. vaginalis-stammar för deras förmåga att bilda reservoarer respektive utlösa deras uppkomst. Andra experimentella faktorer kan också läggas till, såsom exponering för andra vaginala bakterier (t.ex. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller värmedödad G. vaginalis, varav ingen visar patologi i denna modell39. När du väljer andra bakteriestammar att testa är det viktigt att visa konsekvent tillväxt så att en standard inokulumkoncentration kan användas i alla experiment. Tillväxten av JCP8151BSmR har optimerats i en anaerob kammare. Denna stam kan sannolikt odlas i ett anaerobt GasPak-system, men detta skulle kräva optimering för att säkerställa robust bakterietillväxt. Slutligen kan det vara möjligt att ändra tidpunkten för vissa steg i modellen. Till exempel kan urin samlas in vid tidigare tidpunkter under UPEC-reservoarbildningsfasen för att övervaka CFU eller värdsvar. En negativ effekt av att samla urinprover vid tidiga tidpunkter (3, 6, 12 hpi) på infektionens progression eller etablering av reservoarer har inte observerats i denna modell. Uppkomst av UPEC-reservoarer har rapporterats inträffa efter två JCP8151BSmR-doser som ges 12 timmar eller 1 wk, men andra tidsintervall har ännu inte testats. Det kan också vara möjligt att minska den totala tiden för modellen genom att minska UPEC-reservoarbildningsfasen till 2 veckor (snarare än 4 veckor), eftersom många av mössen rensar bakteriuri vid denna tidpunkt. Tidigare studier som undersökte UPEC-uppkomst efter blåsexponering för kemiska exfolieringsmedel använde en 1 eller 2 wk UPEC-reservoarbildningsfas17,18. Att minska tiden för UPEC-bakteriuriclearance kan dock leda till att fler djur måste avlivas från experimentet. Slutligen kan SEM-analys av blåsan utföras vid ytterligare tidpunkter för att observera varaktigheten av effekten av G. vaginalis på urotelet.
När det gäller felsökning finns det några viktiga överväganden specifikt med avseende på blåsans SEM-analys. Beroende på vilken musbakgrund som används och mängden inflammation närvarande, kommer vissa blåsor att presentera med mycket tunna väggar. Dessa blåsor tenderar att krulla mer under kritisk punkttorkning och kan resultera i en cowrie skalliknande form. Om detta inträffar är den bästa metoden att skära den skalformade blåsan i hälften längs det krullade gränssnittet och sedan en andra gång för att ta bort huvuddelen av den överhängande vävnaden. Skärning fungerar bäst med ett PTFE-belagt dubbelkantigt rakblad. Överflödigt fett kan ibland solubiliseras under osmiumfärgningsstegen. Detta kan resultera i oönskade olösliga fettdroppar som kanske inte tvättas bort under sköljnings- och uttorkningsstegen och som kan sätta sig på blåsytan under efterföljande torkning. Dessa droppar kan visas som antingen små sfärer eller skivliknande strukturer utspridda över provet (figur 4D). Detta kan mildras genom att se till att så mycket fettvävnad tas bort från runt urinblåsan som möjligt. Platina kan ersättas med iridiumbeläggning, men tjocklekarna bör hållas till ett minimum för att minska maskering av fina strukturella detaljer. Användning av ett roterande steg under beläggning rekommenderas starkt.
En begränsning med denna modell är att den kräver ett stort antal möss. Endast 65-80% av C57BL /6-möss kommer att rensa sin UPEC-bakteriuri och vara lämplig för efterföljande G. vaginalis– eller PBS-ympning (se figur 2C). För att få 10-12 möss per grupp (G. vaginalis inokulering vs. PBS) bör ~ 30 möss initialt infekteras med UPEC. Vidare krävs sannolikt flera experiment för att uppnå de biologiska replikat som krävs för att detektera statistisk signifikans. När exponeringen gavs 1 wk från varandra inträffade UPEC-uppkomst hos 14% av mössen som exponerades för PBS (figur 3B). Att upptäcka en signifikant ökning av UPEC rUTI hos G. vaginalis-exponerade möss i förhållande till PBS-kontroller (drivs vid 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) kräver att man testar en kumulativ summa på minst 40 möss för varje exponeringsgrupp. Ett ytterligare övervägande är att dessa experiment är dyra och arbetsintensiva. Möss måste övervakas varje vecka för UPEC-clearance och det experimentella tidsförloppet är 4-5 wk beroende på om G. vaginalis ges två gånger inom en tidsram på 12 timmar eller två gånger 1 wk från varandra. SEM är arbetsintensivt och kan vara kostsamt, beroende på mikroskoptillgänglighet och serviceavgifter. Att förbereda hela blåsan för SEM ger rikligt med material för analys men nackdelen är att det kan vara tidskrävande att analysera varje blåsa. Således är det troligt att endast ett begränsat antal blåsor kan analyseras med SEM jämfört med det högre djurantalet som används för urin- och vävnadstitrar. Dessutom kräver högkvalitativa bilder av blåsans “koppar” böjda ytor skicklighet på grund av skuggor som kan hindra synligheten. Även om blåsan SEM är ett användbart verktyg för att visualisera urotelial exfoliering, är denna metod till stor del kvalitativ. Eftersom provet är fixerat i en rund form, och på grund av användningen av glutaraldehyd i fixeringsmedlet, är screening för fluorescerande uttryckande bakterier via ljusmikroskopi inte möjlig. Immunfärgning och kemiska färgämnen är oförenliga med denna process på grund av användningen av glutaraldehyd som kommer att tvärbinda de flesta antigener och osmium och som kommer att maskera antigenställen och mörka vävnaden. Som sagt, SEM-tekniken är användbar för parametrar som kan utvärderas kvantitativt utan användning av ytterligare sonder, såsom cellstorlek48,49.
Denna modell erbjuder flera fördelar utöver tidigare beskrivna metoder. Det möjliggör undersökning av mekanismer för UPEC rUTI orsakad av uppkomst från blåsreservoarer, i motsats till återinförande i blåsan från en extern källa. Andra modeller av rUTI på grund av uppkomst från blåsreservoarer använder kemiska medel (protaminsulfat eller kitosan) för att orsaka urotelial exfoliering 17,18, vilket inte skulle vara utlösare av rUTI hos kvinnor. G. vaginalis är en utbredd urogenital bakterie som har detekterats i urin som samlats in direkt från urinblåsan via kateterisering eller suprapubisk aspiration hos vissa kvinnor23,26. Detta faktum, tillsammans med den kända kopplingen mellan BV (där G. vaginalis växer över i slidan) och UTI, tyder på att G. vaginalis är en kliniskt trolig utlösare av rUTI. Slutligen bevarar in situ-blåsfixeringsmetoden blåsans ultrastruktur och begränsar skador, vilket säkerställer att blåsskikten inte separeras från varandra. Tidigare metoder för att visualisera urotelium har traditionellt fått användaren att aseptiskt skörda, bisekera, sträcka och fästa blåsan på en dissektionsbricka innan den förlängda urinblåsan sänks ner i fixativ48. Denna metod resulterar i ett mycket platt prov men säkerställer inte jämn eller naturlig sträckning av vävnaden och kan resultera i områden som är över och under sträckta (vilket resulterar i mycket skrynklig vävnad) och kan orsaka separation av blåsskiktet. Dessutom kan dessa fysiska manipuleringar av urinblåsan för att sträcka och stifta vävnaden orsaka skador, inklusive urotelial exfoliering. En annan metod är att sänka ner intakta blåsor i fixativ innan de bäddas in i paraffin och förvärvar tunna sektioner med en mikrotom. Tunna sektioner är ovärderliga för immunohistokemiska experiment för att undersöka bakterier och värdproteinlokalisering men en tunn sektion tillåter inte visualisering av den uroteliala ytan. Denna SEM-metod gör att ytan på hela blåsan kan undersökas på en gång.
Som beskrivits inkluderar framtida tillämpningar av denna modell testning av andra UPEC-stammar för att avgöra om de bildar intracellulära reservoarer och testning av andra G. vaginalis-stammar för att bedöma om de framkallar exfoliering och UPEC-uppkomst för att orsaka rUTI. Andra musstammar utöver C57BL/6-möss kan också testas, även om möss med hög benägenhet att utveckla kronisk cystit (såsom möss på C3H-bakgrunden) inte rekommenderas, eftersom för många möss skulle behöva avlivas från experimentet. En ytterligare fördel med C57BL/6-möss är att många genetiska knockout-stammar är kommersiellt tillgängliga. Sådana stammar ger möjlighet att förhöra de värdfaktorer som är involverade i reservoarbildning och / eller uppkomst.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Lynne Foster för tekniskt bistånd i infektionsexperiment, James Fitzpatrick vid Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) för tillgång till SEM, Scott Hultgren för UTI89kanR UPEC-stammen och David Hunstad för kritisk läsning av manuskriptet.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (Graduate Research Fellowship till VPO #DGE – 1143954), av Center for Women’s Infectious Disease Research vid Washington University School of Medicine (Pilot Research Award till NMG), av American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) och #14POST20020011 (NMG) och av National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) och NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) och K01 DK110225-01A1 (NMG). Några av djurstudierna utfördes i en anläggning som stöds av NCRR-bidrag C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; där SEM utfördes) och MSJ stöddes av Washington University School of Medicine, Children’s Discovery Institute of Washington University och St. Louis Children’s Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) och National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.
30G x 1/2 needles | BD | 305106 | for catheters |
5 1/2" straight forcep hemostat | McKesson | 487377 | in situ bladder fixation |
ACE 600 Sputter coater | Leica | SEM sample processing | |
aluminum SEM stub | Ted Pella | 16111 | SEM sample processing |
Calcium chloride | EMS | 12340 | in situ bladder fixation |
conductive carbon adhesive tab | Ted Pella | 16084-1 | SEM sample processing |
Conductive silver paint | Ted Pella | 16034 | SEM sample processing |
CPD 300 Critical Point Drier | Leica | SEM sample processing | |
Cytofunnel metal clip | Simport | M964B | cytospun urinalysis |
Ethanol | EMS | 15050 | SEM sample processing |
Glucose | Sigma | G7528 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
glutaraldehyde | EMS | 16320 | in situ bladder fixation |
Hema 3 staining kit | Fisher | 23123869 | cytospun urinalysis |
HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | for NYCIII G. vaginalis growth media |
iridium | Ted Pella | 91120 | SEM sample processing |
isofluorane | mouse anaesthesia | ||
kanamycin | Gibco | 11815024 | add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL) |
Luria-Bertani agar | BD | DF0445174 | UPEC growth plates |
Luria-Bertani broth | BD | DF0446173 | UPEC growth media |
Merlin FE-SEM | Zeiss | scanning electron microscope | |
Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | SEM sample processing |
NaCl | Sigma | S3014 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
Olympus Vanox AHBT3 microscope | Olympus | cytospun urinalysis | |
osmium tetroxide | EMS | 19170 | SEM sample processing |
paraformaldehyde | EMS | 15710 | in situ bladder fixation |
polyethylene tubing | Intramedic | 427401 | for catheters |
Proteose Peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | for NYCIII G. vaginalis growth media |
PTFE coated double edge razor blade | EMS | 72000 | cutting bladders for SEM |
Shandon Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300002 | cytospun urinalysis |
Shandon cytofunnel filter | Simport | M965FWDV | cytospun urinalysis |
Shandon Double cytofunnel | Simport | M964-1D | cytospun urinalysis |
Shandon double cytoslides (coated) | Thermo Scientific | 5991055 | cytospun urinalysis |
sodium cacodylate trihydrate | EMS | 12310 | in situ bladder fixation |
spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
streptomycin | Gibco | 11860038 | add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL) |
tuberculin slip tip syringe | BD | 309659 | for catheters |
Yeast Extract | Fisher | DF0127-17-9 | for NYCIII G. vaginalis growth media |