Описано универсальное микрофлюидное устройство, позволяющее кристаллизовать фермент с использованием метода контрдиффузии, введение субстрата в кристаллы путем замачивания и определение 3D-структуры фермента: субстратный комплекс путем последовательного анализа кристаллов внутри чипа при комнатной температуре.
Подготовка кристаллов диффрактинга и их обработка перед рентген-анализом являются двумя критическими шагами биокристаллографических исследований. Мы описываем универсальный микрофлюидный чип, который позволяет производство кристаллов эффективным методом борьбы с диффузией. Среда, свободная от конвекции, предоставляемая микрофлюидными каналами, идеально подходит для роста кристаллов и полезна для распространения субстрата в активное место кристаллического фермента. Здесь мы применили этот подход к ферменту CCA-добавления психофильной бактерии Planococcus halocryophilus в представленном примере. После кристаллизации и субстратной диффузии/замачивания кристаллическая структура фермента: субстратный комплекс определялся при комнатной температуре по серийной кристаллографии и анализу нескольких кристаллов непосредственно внутри чипа. Вся процедура сохраняет подлинные дифракционные свойства образцов, поскольку она не требует обработки кристалла.
Кристаллография является методом расшифровки 3D-архитектуры биологических макромолекул. Последнее важно понять, как фермент подбирает и обрабатывает свои субстраты. Определение кристаллической структуры требует кристаллизации целевого макромолекулы и кондиционирования кристаллов для их анализа рентгеновской дифракцией1. Как подготовка кристалла, так и обработка являются важными, но деликатными шагами, которые могут повлиять на качество кристалла и дифракционные свойства, и, таким образом, разрешение (т.е. точность) полученной 3D структуры. Для облегчения подготовки высококачественных кристаллов и устранения ненужной обработки для сохранения их дифракционных свойств, мы разработали удобное и универсальное микрофлюидное устройство под названием ChipX2,3,4.
В этой статье мы продемонстрируем, как загрузить белковый раствор в каналы ChipX с использованием обычного лабораторного материала для подготовки кристаллов путем контр-диффузии. Этот метод кристаллизации обеспечивает эффективный скрининг супернасыщения и потенциальных условий нуклеации вдоль микрофлюидных каналов, содержащих ферментный раствор из-за градиента концентрации, генерируемого диффузией кристаллизирующегоагента 5,6.
Установка чипа проста, она использует только стандартные лабораторные пипетки и не требует дорогостоящего оборудования. Когда кристаллы выросли в ChipX, лиганды фермента могут быть введены путем диффузии. Затем данные дифракции собираются при комнатной температуре по ряду кристаллов, содержащихся в каналах чипа с помощью синхротронного рентгеновского источника. Описанное здесь структурное исследование привело к определению структур фермента созревания тРНК в форме апо и в комплексе с аналогом его субстрата CTP, введенного путем замачивания. Этот белок под названием фермент, добавляемый к CCA, полимеризирует тринуклеотидный хвост CCA на 3’конце tRNAs. Сравнение двух 3D-изображений, полученных с помощью серийной кристаллографии, показывает локальные конформациальные изменения, связанные с связыванием лиганда в условиях, которые являются более физиологическими, чем те, которые используются в криокристаллографии. Протокол, описанный в этом видео, как правило, применим к любой биомолекуле, будь то белок, нуклеиновой кислоты или многокомпонентный комплекс.
Текущие протоколы в биокристаллографии включают в себя подготовку кристаллов с использованиемтаких методов, как диффузияпара или партия 13,14 , и их передача в микролупе длякрио-охлаждения 15,16 перед выполнением дифракции анализа в азотной струи в криогенных условиях. В отличие от этого, прямое кристаллическое крио-охлаждение не возможно в ChipX3 и кристаллы не могут быть извлечены из их микрофлюидного канала, который можно рассматривать как ограничения этой установки. Однако протокол, описанный в статье, предусматривает полностью интегрированный трубопровод для определения кристаллических структур при комнатной температуре (т.е. в более физиологических условиях). Несмотря на то, что сбор данных при комнатной температуреприводит к увеличению радиационного ущерба 19,этот эффект уравновешивается быстрым временем сбора данных (на каждом кристалле собирается максимальное вращение 60 градусов) и слиянием нескольких частичных наборов данных. Оба ChipX дизайн и материал были оптимизированы для уменьшения рассеяния фона и дифракциисигнала затухания 3, и сбор данных может быть выполнен на кристаллах с размерами, эквивалентными половине размера каналов (40 мкм)4.
Подводя итог, можно сказать, что основные преимущества протокола следующие. Кристаллы производятся в конвекционной среде (микрофлюидных каналах), что очень благоприятно для роста высококачественных кристаллов. Метод борьбы с диффузией, внедренный в ChipX, очень эффективен при скрининге ландшафта супернасыщения; диффузия кристаллантов в канал чипа создает концентрацию и волны супернасыщения, которая помогает определить соответствующие условия нуклеации и роста5. Кристаллы никогда непосредственно обрабатываются, но анализируются на месте, внутри чипа, который сохраняет их подлинные дифракционные свойства (т.е. не изменяет кристаллическую мозаику физическим взаимодействием или криоколированием)20. Дифракционный анализ проводится на серии кристаллов, распределенных по каналам чипа с низкой дозой воздействия, чтобы свести к минимуму повреждение излучения, и полный набор данных собирается путем слияния частичных данных из серии. Стандартный след и простой дизайн ChipX позволят в будущем полностью автоматизировать сбор данных на месте с использованием синхротрона или XFEL объектов. Все этапы протокола выполняются в ChipX. С точки зрения экспериментатора, установка чипов проста и проста в работе со стандартными трубами и не требует дополнительного оборудования. Соединение канала, похожее на дерево, на входе образца сводит к минимуму мертвые объемы в системе, что важно при работе с образцами, которые трудно очистить или которые доступны только в ограниченном количестве.
В заключение, подход «лаборатория-на-чипе», реализованный в ChipX, упрощает и эффективно миниатюризирует процесс кристаллизации путем определения контрдиффузии и кристаллической структуры, что позволяет перейти от образца к его 3D-структуре в одном устройстве. Он широко применим и предлагает удобное, экономически эффективное решение для обычных серийных исследований биокристаллографии при комнатной температуре.
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают Швейцарский Источник Света (Villigen, Швейцария) за выделение времени луча для проекта на лучах X10SA (PXII) и X06DA (PXIII), Александра Блюм за ее вклад в усовершенствование структуры, Кларисса Уорсдейл для записи закадрового голоса и Франсуа Шнелл (Страсбургский университет) за помощь в редактировании видео и SFX. Эта работа была поддержана Французским центром Национального де ла Recherche Scientifique (CNRS), Страсбургский университет, консорциум LabEx “NetRNA” (ANR-10-LABX-0036_NETRNA), phD-финансирование R.dW от инициативы Excellence (IdEx) Страсбургского университета в рамках французской национальной программы “Инвестиции д’Авенир”, кандидат финансирования К.Р. от Франко-германского университета (UFA-DFH, грант нет. CT-30-19), Deutsche Forschungsgemeinschaft (грант No. Mo 634/10-1). Авторы воспользовались программой сотрудничества PROCOPE Hubert Curien (Министерство иностранных дел Франции и Deutscher Akademischer Austauschdienst).
Axioscope A1 stereomicroscope | Zeiss | Crystal observation (step 3) | |
Carboxyrhodamine succinimidyl ester | Invitrogen | C-6157 | Protein labeling (step 2) |
CMPcPP | Jena Bioscience | NU-438 | Crystal soaking (step 4) |
Crystal clear sealing tape | Hampton research | HR3-511 | ChipX sealing (step 1) |
Parafin oil | Hampton research | HR3-411 | ChipX loading (step 1) |
Ultimaker 2 extended+ | Ultimaker | 3D printer – Representative results | |
UV light source | Xtal Concepts Gmbh | XtalLight100c | Crystal observation (step 3) |
Zeba spin desalting column 7K MWCO | ThermoFisher Scientific | 89882 | Protein labeling (step 2) |