Fetal ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Türevi Oligodendrosit Öncül Hücre Kültürlerinin Yüksek İçerik tarama farklılaşması ve olgunlaşma analizi
Summary
Olgun oligodendrositlere dönüşen fetal veya yetişkin nöral kök hücrelerden elde edilen astrositlerin ve oligodendrosit öncül hücrelerin karma kültürlerinin üretimini ve zararlı uyaranların in vitro modellemesini anlatıyoruz. Hücre tabanlı yüksek içerikli tarama tekniği ile bağlantı, güvenilir ve sağlam bir ilaç tarama sistemi oluşturur.
Abstract
Karmaşık hastalıklarda terapötik stratejilerin etkinliğini değerlendirmek için ilaç tarama tekniklerinin geliştirilmesindeki temel engel, in vitro basitleştirme ve karmaşık in vivo ortamını yeniden oluşturma ile tüm tarama stratejileri tarafından paylaşılan, sağlam ve güvenilir veriler elde etme, in vivo çeviri için son derece tahmine dayalı ana amaç arasında bir denge oluşturmaktır.
Demyelinize edici hastalıklar alanında, ilaç tarama stratejilerinin çoğu, yenidoğan hayvanlardan izole edilmiş primer oligodendrosit öncül hücrelerinin (OPC) ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına veya saf kültürlerine dayanmaktadır ve yaşa bağlı farklılıkların olmaması ve herhangi bir gerçek patolojik durum veya karmaşıklık nedeniyle güçlü önyargılara yol açmaktadır.
Burada, demiyelinasyon hastalıklarının tipik patolojik durumlarını taklit etmek için kolayca manipüle edilen nöral kök hücre (NSC) türevi OPC’lerin fizyolojik farklılaşmasını / olgunlaşmasını modellemeyi amaçlayan bir in vitro sistemin kurulumunu gösteriyoruz. Ayrıca, yöntem fetal ve yetişkin beyinlerinden izolasyonu içerir ve Astrositleri de içeren spontan bir ortak kültürde OPC’lerden olgun oligodendrositlere (OL’ ler) dinamik olarak farklılaşan bir sistem verir. Bu model fizyolojik olarak tiroid hormon aracılı miyelinasyon ve miyelin onarım sürecine benzer ve hastalık mekanizmalarını model alan patolojik interferanların eklenmesini sağlar. Demiyelinasyon hastalıklarının iki ana bileşenini (yani hipoksi/ iskemi ve inflamasyon), gelişimsel miyelinasyon ve yetişkin miyelin onarımı üzerindeki etkilerini yeniden yaratmayı ve OPC’leri ayırt etmeye odaklanırken sistemin tüm hücre bileşenlerini dikkate almayı gösteriyoruz.
Bu spontan karma model, hücre tabanlı yüksek içerikli tarama teknolojileriyle birleştiğinde, demyelinasyonda yer alan patolojik süreçlerle mücadele etmeyi ve remyelinasyonu teşvik etmeyi amaçlayan terapötik stratejiler için sağlam ve güvenilir bir ilaç tarama sisteminin geliştirilmesini sağlar.
Introduction
Merkezi sinir sisteminde (CNS), miyelin oluşturan hücreler (oligodendrositler, OL’ler) ve öncülleri (oligodendrosit öncül hücreler, OPC’ler) gelişimsel miyelinasyondan, peri ve doğum sonrası dönemlerde meydana gelen bir süreçten ve yetişkinlikte miyelin ciro ve onarımından (remiyelinasyon) sorumludur1. Bu hücreler son derece uzmanlaşmıştır, anatomik ve fonksiyonel olarak diğer tüm glial ve nöronal bileşenlerle etkileşime girer ve bu da onları CNS yapısının ve işlevinin temel bir parçası haline getirir.
Demiyelinerasyon olayları farklı CNS yaralanmaları ve hastalıkları2‘de yer almaktadır ve esas olarak hem gelişim hem de yetişkinlik döneminde çok yönlü mekanizmalar yoluyla OPC’ler ve OL’ler üzerinde hareket eder. Farklılaşmamış öncüller, başta tiroid hormonu (TH) olmak üzere farklılaşan faktörler tarafından yönlendirilir, senkronize bir işlem3’te, OPC’nin çoğalmaya, miyelinlenmemiş aksona göçe ve miyelin kılıtını geliştiren olgun OL’lere farklılaşmaya neden olan belirli uyaranları tanımasına ve yanıt vermesine neden olur4. Tüm bu işlemler ince bir şekilde kontrol edilir ve karmaşık bir ortamda gerçekleşir.
Miyelinasyon, remiyelinasyon ve demiyelinasyon olaylarının karmaşık doğası nedeniyle, temel mekanizmaları incelemek ve ana hücresel oynatıcıya odaklanarak yeni terapötik stratejiler geliştirmek için basitleştirilmiş ve güvenilir bir in vitro yönteme büyük ihtiyaç vardır: OPC5.
Bir in vitro sistemin güvenilir olması için bir dizi faktörün dikkate alınması gerekir: hücresel ortamın karmaşıklığı, yaşa bağlı hücre içsel farklılıklar, fizyolojik TH aracılı farklılaşma, patolojik mekanizmalar ve verilerin sağlamlığı6. Gerçekten de, alandaki karşılanmamış ihtiyaç, in vivo durumun karmaşıklığını taklit eden, izole saf OPC kültürlerinin kullanımıyla başarıyla elde edilmeyen bir modeldir. Ek olarak, demiyelinasyon olaylarının iki ana bileşeni olan inflamasyon ve hipoksi/iskemi (HI), aşırı basitleştirilmiş in vitro modellerde çalışılamayan bir yön olan OPC’lerin fizyolojik farklılaşmasını ve olgunlaşmasını dolaylı olarak etkileyebilecek diğer hücre bileşenlerini doğrudan içerir.
Son derece tahmine dayalı bir kültür sisteminden başlayarak, sonraki ve daha genel zorluk sağlam ve güvenilir verilerin üretilmesidir. Bu bağlamda, hücre tabanlı yüksek içerikli tarama (HCS) en uyguntekniktir 7, çünkü amacımız öncelikle tüm kültürü otomatik bir iş akışında analiz etmek, temsili alanlar seçme önyargısını önlemek ve ikincisi görüntüleme tabanlı yüksek içerikli verilerin otomatik ve eşzamanlı neslini eldeetmektir 8.
Temel ihtiyacın in vitro basitleştirme ve in vivo taklit karmaşıklık arasında en iyi dengeyi sağlamak olduğu göz önüne alındığında, burada fetal forebrandan ve yetişkin alt ventrikül bölgesinden (SVZ) izole edilmiş sinirsel kök hücrelerden (NSC’ ler) elde edilen OPC’leri elde etmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Bu in vitro model, çok güçlü NSC’den olgun/miyelinasyon ol’a kadar tüm OPC farklılaşma sürecini fizyolojik TH’ye bağımlı bir şekilde kapsar. Ortaya çıkan kültür, dinamik olarak farklılaşan/olgunlaşan bir sistemdir ve bu da esas olarak nöronların düşük bir yüzdesiyle, farklılaşan OPC’ler ve astrositlerden oluşan spontan bir ortak kültürle sonuçlanır. Bu birincil kültür karmaşık in vivo ortamı daha iyi taklit ederken, kök hücre türetme, istenen hücre soy zenginleştirmesini elde etmek için basit manipülasyonların yapılmasına izin verir.
Hücre hatlarını veya birincil OPC’lerin saf kültürlerini kullanan diğer ilaç tarama stratejilerinin aksine, burada açıklanan yöntem, patolojik interferentlerin veya terapötik moleküllerin karmaşık bir ortamda, istenen hücre tipine odaklanmayı kaybetmeden etkisinin araştırılmasına izin verir. Açıklanan HCS iş akışı, hücre canlılığı ve soy spesifikasyonunun yanı sıra soyuna özgü hücre ölümü ve morfolojik parametrelerin analizine izin sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Miyelinasyon/remiyelinasyon süreçlerinin ve demiyelinasyon olaylarının karmaşık doğası, tahmine dayalı in vitro sistemlerin geliştirilmesini son derece zorlaştırmamaktadır. En yaygın olarak kullanılan in vitro ilaç tarama sistemleri çoğunlukla insan hücre hatları veya birincil saf OL kültürleridir, daha karmaşık ortak kültürlerin veya organotipik sistemlerin artan kullanımıile 15. Bu tür sistemler yüksek içerikli teknolojilerle birleşse bile, saf OL kültürleri tar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744) ve Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020 tarafından desteklenmektedir.
Deneysel çalışmalara ev sahipliği yaptığı için IRET Vakfı’na özel teşekkürler.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
References
- Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340 (2015).
- Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
- Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
- Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
- Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
- Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
- Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, 1-80 (2014).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, 241-252 (2010).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443 (2019).
- Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750 (2019).
- Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
- Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419 (2016).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
- Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin – from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
- Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
- Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
- Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681 (2020).
- Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
- Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620 (2013).
- Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).
