Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas
Summary
Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.
Abstract
El principal obstáculo en el desarrollo de técnicas de cribado farmacológico para evaluar la eficacia de las estrategias terapéuticas en enfermedades complejas es lograr un equilibrio entre la simplificación in vitro y la recreación del complejo entorno in vivo, junto con el objetivo principal, compartido por todas las estrategias de cribado, de obtener datos robustos y fiables, altamente predictivos para la traducción in vivo.
En el campo de las enfermedades desmielinizantes, la mayoría de las estrategias de detección de fármacos se basan en líneas celulares inmortalizadas o cultivos puros de células precursoras de oligodendrocitos primarios (OPC) aisladas de animales recién nacidos, lo que lleva a fuertes sesgos debido a la falta de diferencias relacionadas con la edad y de cualquier condición o complejidad patológica real.
Aquí mostramos la configuración de un sistema in vitro destinado a modelar la diferenciación fisiológica / maduración de las OPC derivadas de células madre neurales (NSC), fácilmente manipulables para imitar las condiciones patológicas típicas de las enfermedades desmielinizantes. Además, el método incluye el aislamiento de cerebros fetales y adultos, dando un sistema que se diferencia dinámicamente de los OPC a los oligodendrocitos maduros (OL) en un cocultivo espontáneo que también incluye astrocitos. Este modelo se asemeja fisiológicamente al proceso de mielinización y reparación de mielina mediado por hormona tiroidea, lo que permite la adición de interferentes patológicos que modelan los mecanismos de la enfermedad. Mostramos cómo imitar los dos componentes principales de las enfermedades desmielinizantes (es decir, hipoxia / isquemia e inflamación), recreando su efecto sobre la mielinización del desarrollo y la reparación de la mielina adulta y teniendo en cuenta todos los componentes celulares del sistema en todo momento, mientras nos centramos en diferenciar los OPC.
Este modelo mixto espontáneo, junto con las tecnologías de cribado de alto contenido basadas en células, permite el desarrollo de un sistema de cribado farmacológico robusto y fiable para estrategias terapéuticas dirigidas a combatir los procesos patológicos implicados en la desmielinización y a inducir la remielinización.
Introduction
En el sistema nervioso central (SNC), las células formadoras de mielina (oligodendrocitos, OL) y sus precursores (células precursoras de oligodendrocitos, OPC) son responsables de la mielinización del desarrollo, un proceso que ocurre durante los períodos peri y postnatal, y del recambio y reparación de la mielina (remielinización) en la edad adulta1. Estas células están altamente especializadas, interactuando anatómica y funcionalmente con todos los demás componentes gliales y neuronales, lo que las convierte en una parte fundamental de la estructura y función del SNC.
Los eventos desmielinizantes están implicados en diferentes lesiones y enfermedades delSNC 2,y actúan principalmente sobre OPC y OL mediante mecanismos multifactoriales, tanto durante el desarrollo como en la edad adulta. Los precursores indiferenciados son impulsados por factores diferenciadores, principalmente la hormona tiroidea (TH), en un proceso sincronizado3 que lleva al OPC a reconocer y responder a estímulos específicos que inducen la proliferación, la migración al axón no mielinizado y la diferenciación en OL maduros que a su vez desarrollan la vaina de mielina4. Todos estos procesos están finamente controlados y ocurren en un entorno complejo.
Debido a la naturaleza compleja de los eventos de mielinización, remielinización y desmielinización, existe una gran necesidad de un método in vitro simplificado y confiable para estudiar los mecanismos subyacentes y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, centrándose en el principal actor celular: el OPC5.
Para que un sistema in vitro sea fiable, es necesario tener en cuenta una serie de factores: la complejidad del entorno celular, las diferencias intrínsecas celulares relacionadas con la edad, la diferenciación fisiológica mediada por TH, los mecanismos patológicos y la robustez de los datos6. De hecho, la necesidad insatisfecha en el campo es un modelo que imita la complejidad de la condición in vivo, no lograda con éxito mediante el uso de cultivos OPC puros aislados. Además, los dos componentes principales de los eventos desmielinizantes, la inflamación y la hipoxia/isquemia (HI), involucran directamente a otros componentes celulares que pueden afectar indirectamente la diferenciación fisiológica y la maduración de los OPC, un aspecto que no puede estudiarse en modelos in vitro demasiado simplificados.
Partiendo de un sistema de cultivo altamente predictivo, el desafío posterior y más general es la producción de datos robustos y confiables. En este contexto, el cribado de alto contenido basado en células (HCS) es la técnica más adecuada7,ya que nuestro objetivo es, en primer lugar, analizar todo el cultivo en un flujo de trabajo automático, evitando el sesgo de elegir campos representativos, y en segundo lugar obtener la generación automática y simultánea de datos de alto contenido basados en imágenes8.
Dado que la principal necesidad es lograr el mejor equilibrio entre la simplificación in vitro y la complejidad que imita in vivo, aquí presentamos un método altamente reproducible para la obtención de OPC derivadas de células madre neurales (NSC) aisladas del cerebro anterior fetal y de la zona subventricular adulta (SVZ). Este modelo in vitro abarca todo el proceso de diferenciación de OPC, desde NSC multipotente hasta OL maduro / mielinizante, de una manera fisiológica dependiente de TH. El cultivo resultante es un sistema dinámicamente diferenciador/madurador que da como resultado un cocultivo espontáneo que consiste principalmente en diferenciar OPCs y astrocitos, con un bajo porcentaje de neuronas. Este cultivo primario imita mejor el complejo entorno in vivo, mientras que su derivación de células madre permite realizar manipulaciones simples para obtener el enriquecimiento del linaje celular deseado.
A diferencia de otras estrategias de cribado farmacológico mediante líneas celulares o cultivos puros de OPC primarios, el método aquí descrito permite estudiar el efecto de interferentes patológicos o moléculas terapéuticas en un entorno complejo, sin perder el foco en el tipo celular deseado. El flujo de trabajo de HCS descrito permite un análisis de la viabilidad celular y la especificación del linaje, así como la muerte celular específica del linaje y los parámetros morfológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La naturaleza compleja de los procesos de mielinización/remielinización y los eventos desmielinizantes hace que el desarrollo de sistemas predictivos in vitro sea extremadamente desafiante. Los sistemas de cribado de fármacos in vitro más utilizados son en su mayoría líneas celulares humanas o cultivos PRIMARIOS PUROS DE OL, con un uso cada vez mayor de cocultivos u sistemas organotípicos más complejos15. Incluso si tales sistemas se combinan con tecnologías de alto contenido, los cultivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Con el apoyo del proyecto MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), y Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Un agradecimiento especial a la Fundación IRET por acoger el trabajo experimental.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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