भ्रूण और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल-व्युत्पन्न ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत सेल संस्कृतियों की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग भेदभाव और परिपक्वता विश्लेषण
Summary
हम भ्रूण या वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं की मिश्रित संस्कृतियों के उत्पादन का वर्णन परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स में अंतर करते हैं, और हानिकारक उत्तेजनाओं के विट्रो मॉडलिंग में। सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक के साथ युग्मन एक विश्वसनीय और मजबूत दवा स्क्रीनिंग प्रणाली बनाता है।
Abstract
जटिल रोगों में चिकित्सीय रणनीतियों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए दवा स्क्रीनिंग तकनीकों को विकसित करने में मुख्य बाधा इन विट्रो सरलीकरण और वीवो पर्यावरण में जटिल को पुनः बनाने के बीच संतुलन बना रही है, साथ ही मुख्य उद्देश्य के साथ, सभी स्क्रीनिंग रणनीतियों द्वारा साझा किया गया, मजबूत और विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने का, वीवो अनुवाद में अत्यधिक भविष्य कहनेवाला ।
रोगों के क्षेत्र में, अधिकांश दवा स्क्रीनिंग रणनीतियां अमर कोशिका रेखाओं या नवजात जानवरों से अलग प्राथमिक ओलिगोडेन्ड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (ओपीसी) की शुद्ध संस्कृतियों पर आधारित होती हैं, जिससे उम्र से संबंधित मतभेदों की कमी और किसी भी वास्तविक रोग की स्थिति या जटिलता के कारण मजबूत पूर्वाग्रह होते हैं।
यहां हम तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के शारीरिक भेदभाव/परिपक्वता को मॉडलिंग करने के उद्देश्य से एक इन विट्रो प्रणाली के सेटअप को दिखाते हैं, जो आसानी से रोग की स्थिति की नकल करने के लिए हेरफेर किया जाता है जो बीमारियों के विशिष्ट होते हैं । इसके अलावा, विधि भ्रूण और वयस्क दिमाग से अलगाव भी शामिल है, एक प्रणाली है जो गतिशील OPCs से एक सहज सह संस्कृति में परिपक्व ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स (OLs) के लिए अंतर दे रही है जो भी एस्ट्रोसाइट्स भी शामिल है । यह मॉडल शारीरिक रूप से थायराइड हार्मोन-मध्यस्थता वाले माइलियनेशन और मायलिन मरम्मत प्रक्रिया जैसा दिखता है, जिससे रोग इंटरफेरेंट्स के अलावा रोग इंटरफेरेंट्स को शामिल किया जा सकता है जो रोग तंत्र को मॉडल करते हैं। हम दिखाते हैं कि ओपीसी में अंतर करते हुए, विकासात्मक माइलेशन और वयस्क मायलिन मरम्मत पर उनके प्रभाव को पुन: बनाने और सिस्टम के सभी सेल घटकों को ध्यान में रखते हुए, रोगों (यानी, हाइपोक्सिया/इस्केमिया और सूजन) के दो मुख्य घटकों की नकल कैसे करें।
यह सहज मिश्रित मॉडल, सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्रौद्योगिकियों के साथ मिलकर, चिकित्सीय रणनीतियों के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय दवा स्क्रीनिंग प्रणाली के विकास की अनुमति देता है जिसका उद्देश्य जनसांख्यिकी में शामिल रोग प्रक्रियाओं का मुकाबला करना और रेमाइलेशन को प्रेरित करना है।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, माइलिन बनाने वाली कोशिकाएं (ओलिगोडेन्ड्रोसाइटेसाइट्स, ओएलएस) और उनके अग्रदूत (ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रीकरसोर कोशिकाएं, ओपीसी) विकासात्मक माइलिनेशन के लिए जिम्मेदार हैं, एक प्रक्रिया जो पेरी-और प्रसव के बाद की अवधि के दौरान होती है, और वयस्क1में माइलिन टर्नओवर और मरम्मत (रेमीलेशन) के लिए। ये कोशिकाएं अत्यधिक विशिष्ट हैं, जो अन्य सभी ग्लियल और न्यूरोनल घटकों के साथ शारीरिक रूप से और कार्यात्मक रूप से बातचीत करती हैं, जिससे उन्हें सीएनएस संरचना और कार्य का एक मौलिक हिस्सा मिल जाता है।
Demyelinating घटनाओं विभिन्न सीएनएस चोटों और रोगों 2 में शामिल हैं, और मुख्य रूप से विकास और वयस्कता दोनों केदौरानबहुकारक तंत्र के माध्यम से OPCs और OLs पर कार्य करते हैं । अविभेदित अग्रदूत एक सिंक्रोनाइज्ड प्रक्रिया3 में कारकों में अंतर, मुख्य रूप से थायराइड हार्मोन (टीएच) से प्रेरित होते हैं, जो ओपीसी को विशिष्ट उत्तेजनाओं को पहचानने और उनका जवाब देने के लिए प्रेरित करता है जो प्रसार, गैर-myelinated अक्षतंतु में पलायन, और परिपक्व ओल्स में भेदभाव जो बदले में माइलिन म्यान4विकसित करते हैं। इन सभी प्रक्रियाओं को बारीक नियंत्रित किया जाता है और एक जटिल वातावरण में होते हैं।
माइलियनेशन, रेमाइलेशन और डिमीलेशन इवेंट्स की जटिल प्रकृति के कारण, अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने और मुख्य सेलुलर खिलाड़ी पर ध्यान केंद्रित करते हुए नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए विट्रो विधि में एक सरलीकृत और विश्वसनीय की बहुत आवश्यकता है: ओपीसी5।
इन विट्रो सिस्टम को विश्वसनीय बनाने के लिए, कई कारकों को ध्यान में रखने की आवश्यकता है: सेलुलर पर्यावरण की जटिलता, उम्र से संबंधित सेल-आंतरिक मतभेद, शारीरिक टीएच-मध्यस्थता भेदभाव, रोग तंत्र, और डेटा की मजबूती6। दरअसल, क्षेत्र में अपूर्ण जरूरत एक मॉडल है जो वीवो स्थिति में की जटिलता की नकल करता है, जो अलग शुद्ध ओपीसी संस्कृतियों के उपयोग के माध्यम से सफलतापूर्वक हासिल नहीं होता है। इसके अलावा, घटनाओं, सूजन और हाइपोक्सिया/इस्केमिया (एचआई) के दो मुख्य घटकों में सीधे तौर पर अन्य सेल घटक शामिल हैं जो अप्रत्यक्ष रूप से ओपीसी के शारीरिक भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित कर सकते हैं, एक ऐसा पहलू जिसका अध्ययन ओवर-सरल इन विट्रो मॉडल में नहीं किया जा सकता है ।
एक अत्यधिक भविष्य कहनेवाला संस्कृति प्रणाली से शुरू, बाद में और अधिक सामान्य चुनौती मजबूत और विश्वसनीय डेटा का उत्पादन है। इस संदर्भ में, सेल-आधारित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) सबसे उपयुक्त तकनीक7है, क्योंकि हमारा उद्देश्य सबसे पहले एक स्वचालित कार्यप्रवाह में पूरी संस्कृति का विश्लेषण करना है, प्रतिनिधि क्षेत्रों को चुनने के पूर्वाग्रह से बचना है, और दूसरा इमेजिंग-आधारित उच्च सामग्री डेटा8की स्वचालित और एक साथ पीढ़ी प्राप्त करना है।
यह देखते हुए कि मुख्य आवश्यकता विट्रो सरलीकरण और वीवो-नकल करने वाली जटिलता के बीच सबसे अच्छा संतुलन प्राप्त करना है, यहां हम भ्रूण पूर्वाभास और वयस्क उप-वेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) से अलग तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) से प्राप्त ओपीसी प्राप्त करने के लिए एक अत्यधिक प्रजनन योग्य विधि प्रस्तुत करते हैं। इस इन विट्रो मॉडल में संपूर्ण ओपीसी विभेदन प्रक्रिया शामिल है, मल्टीपॉटेंट एनएससी से परिपक्व/myelinating राजभाषा तक, शारीरिक टीएच-निर्भर तरीके से । परिणामस्वरूप संस्कृति एक गतिशील रूप से अंतर/परिपक्वता प्रणाली है जिसके परिणामस्वरूप एक सहज सह-संस्कृति होती है जिसमें मुख्य रूप से ओपीसी और एस्ट्रोसाइट्स में अंतर करना होता है, जिसमें न्यूरॉन्स का प्रतिशत कम होता है । यह प्राथमिक संस्कृति वीवो पर्यावरण में जटिल की बेहतर नकल करती है, जबकि इसका स्टेम सेल व्युत्पन्न कोशिका वंश संवर्धन वांछित प्राप्त करने के लिए सरल जोड़तोड़ की अनुमति देता है।
सेल लाइनों या प्राथमिक OPCs की शुद्ध संस्कृतियों का उपयोग कर अन्य दवा स्क्रीनिंग रणनीतियों के विपरीत, यहां वर्णित विधि वांछित सेल प्रकार पर ध्यान केंद्रित किए बिना, एक जटिल वातावरण में पैथोलॉजिकल इंटरफेरेंट्स या चिकित्सीय अणुओं के प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देती है। एचसीएस वर्कफ्लो ने सेल व्यवहार्यता और वंश विनिर्देश के विश्लेषण के साथ-साथ वंश-विशिष्ट कोशिका मृत्यु और रूपात्मक मापदंडों की अनुमति दी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
myelination/remyelination प्रक्रियाओं और demyelinating घटनाओं की जटिल प्रकृति इन विट्रो सिस्टम के विकास को बेहद चुनौतीपूर्ण बनाता है । विट्रो दवा स्क्रीनिंग सिस्टम में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है ज्यादातर मानव सेल …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमआईयूआर नेशनल टेक्नोलॉजी क्लस्टरप्रोजेक्ट आईआरएमआई (CTN01_00177_888744), और एरिटे एमिलिया-रोमाग्ना, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020 द्वारा समर्थित।
प्रयोगात्मक कार्य की मेजबानी के लिए आईआरईटी फाउंडेशन के लिए विशेष धन्यवाद।
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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