High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen
Summary
Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.
Abstract
Die Haupthürde bei der Entwicklung von Arzneimittel-Screening-Techniken zur Beurteilung der Wirksamkeit therapeutischer Strategien bei komplexen Krankheiten besteht darin, ein Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und der Wiederherstellung der komplexen In-vivo-Umgebung zu finden, zusammen mit dem Hauptziel, das von allen Screening-Strategien geteilt wird, robuste und zuverlässige Daten zu erhalten, die für die In-vivo-Translation hochprädiktiv sind.
Im Bereich der demyelinisierenden Erkrankungen basiert die Mehrheit der Arzneimittel-Screening-Strategien auf immortalisierten Zelllinien oder reinen Kulturen isolierter primärer Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) von neugeborenen Tieren, was zu starken Verzerrungen aufgrund des Fehlens altersbedingter Unterschiede und eines realen pathologischen Zustands oder einer realen pathologischen Komplexität führt.
Hier zeigen wir den Aufbau eines In-vitro-Systems, das darauf abzielt, die physiologische Differenzierung / Reifung von aus neuronalen Stammzellen (NSC) abgeleiteten OPCs zu modellieren, die leicht manipuliert werden können, um pathologische Zustände nachzuahmen, die für demyelinisierende Krankheiten typisch sind. Darüber hinaus beinhaltet die Methode die Isolierung von fetalen und erwachsenen Gehirnen, wodurch ein System entsteht, das sich dynamisch von OPCs zu reifen Oligodendrozyten (OLs) in einer spontanen Kokultur unterscheidet, die auch Astrozyten umfasst. Dieses Modell ähnelt physiologisch dem Schilddrüsenhormon-vermittelten Myelinisierungs- und Myelinreparaturprozess, was die Zugabe von pathologischen Interferenzen ermöglicht, die Krankheitsmechanismen modellieren. Wir zeigen, wie man die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Erkrankungen (d.h. Hypoxie/Ischämie und Entzündung) nachahmen kann, indem man ihre Wirkung auf die Entwicklungsmyelinisierung und die adulte Myelinreparatur nachbildet und alle Zellkomponenten des Systems durchgehend berücksichtigt, während wir uns auf die Differenzierung von OPCs konzentrieren.
Dieses spontane Mischmodell, gekoppelt mit zellbasierten High-Content-Screening-Technologien, ermöglicht die Entwicklung eines robusten und zuverlässigen Wirkstoff-Screening-Systems für therapeutische Strategien, die darauf abzielen, die pathologischen Prozesse der Demyelinisierung zu bekämpfen und die Remyelinisierung zu induzieren.
Introduction
Im zentralen Nervensystem (ZNS) sind myelinbildende Zellen (Oligodendrozyten, OLs) und ihre Vorläufer (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, OPCs) für die Entwicklungsmyelinisierung, ein Prozess, der während der peri- und postnatalen Periode auftritt, sowie für den Myelinumsatz und die Myelinreparatur (Remyelinisierung) im Erwachsenenalter verantwortlich1. Diese Zellen sind hochspezialisiert und interagieren anatomisch und funktionell mit allen anderen glialen und neuronalen Komponenten, was sie zu einem grundlegenden Bestandteil der Struktur und Funktion des ZNS macht.
Demyelinisierende Ereignisse sind an verschiedenen ZNS-Verletzungen und-Erkrankungen 2beteiligt und wirken hauptsächlich über multifaktorielle Mechanismen sowohl während der Entwicklung als auch im Erwachsenenalter auf OPCs und OLs. Die undifferenzierten Vorläufer werden durch differenzierende Faktoren, hauptsächlich Schilddrüsenhormon (TH), in einem synchronisierten Prozess3 angetrieben, der den OPC dazu bringt, spezifische Reize zu erkennen und darauf zu reagieren, die Proliferation, Migration zum nicht myelinisierten Axon und Differenzierung in reife OLs induzieren, die wiederum die Myelinscheide entwickeln4. All diese Prozesse werden fein gesteuert und laufen in einem komplexen Umfeld ab.
Aufgrund der komplexen Natur von Myelinisierungs-, Remyelinisierungs- und Demyelinisierungsereignissen besteht ein großer Bedarf an einer vereinfachten und zuverlässigen In-vitro-Methode, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf dem zellulären Hauptakteurliegt:dem OPC 5 .
Damit ein In-vitro-System zuverlässig ist, müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden: die Komplexität der zellulären Umgebung, altersbedingte zellintrinsische Unterschiede, physiologische TH-vermittelte Differenzierung, pathologische Mechanismen und die Robustheit der Daten6. Tatsächlich ist der unerfüllte Bedarf auf diesem Gebiet ein Modell, das die Komplexität des In-vivo-Zustands nachahmt, der durch die Verwendung isolierter reiner OPC-Kulturen nicht erfolgreich erreicht wird. Darüber hinaus betreffen die beiden Hauptkomponenten demyelinisierender Ereignisse, Entzündung und Hypoxie/Ischämie (HI), direkt andere Zellkomponenten, die indirekt die physiologische Differenzierung und Reifung von OPCs beeinflussen können, ein Aspekt, der in zu vereinfachten In-vitro-Modellen nicht untersucht werden kann.
Ausgehend von einem hochprädiktiven Kultursystem besteht die nachfolgende und allgemeinere Herausforderung darin, robuste und zuverlässige Daten zu erzeugen. In diesem Zusammenhang ist das zellbasierte High-Content-Screening (HCS) die am besten geeignete Technik 7 , da es unser Ziel ist, erstens die gesamte Kultur ineinemautomatischen Workflow zu analysieren, die Verzerrung der Auswahl repräsentativer Felder zu vermeiden, und zweitens die automatische und gleichzeitige Generierung von bildgebenden High-Content-Daten zu erhalten8.
Da die Hauptanforderung darin besteht, das beste Gleichgewicht zwischen in vitro Vereinfachung und in vivo-nachahmender Komplexität zu erreichen, stellen wir hier eine hochreproduzierbare Methode zur Gewinnung von OPCs aus neuralen Stammzellen (NSCs) vor, die aus dem fetalen Vorderhirn und der adulten subventrikulären Zone (SVZ) isoliert wurden. Dieses in vitro Modell umfasst den gesamten OPC-Differenzierungsprozess, vom multipotenten NSC bis zur reifen/myelinisierenden OL, physiologisch TH-abhängig. Die resultierende Kultur ist ein dynamisch differenzierendes / reifendes System, das zu einer spontanen Kokultur führt, die hauptsächlich aus differenzierenden OPCs und Astrozyten besteht, mit einem geringen Prozentsatz an Neuronen. Diese Primärkultur ahmt die komplexe In-vivo-Umgebung besser nach, während ihre Stammzellableitung einfache Manipulationen ermöglicht, um die gewünschte Zelllinienanreicherung zu erhalten.
Im Gegensatz zu anderen Drug-Screening-Strategien unter Verwendung von Zelllinien oder Reinkulturen primärer OPCs ermöglicht die hier beschriebene Methode die Untersuchung der Wirkung pathologischer Interferenzen oder therapeutischer Moleküle in einer komplexen Umgebung, ohne den Fokus auf den gewünschten Zelltyp zu verlieren. Der beschriebene HCS-Workflow erlaubt eine Analyse der Zelllebensfähigkeit und Abstammungsspezifikation sowie des linienspezifischen Zelltods und morphologischer Parameter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Komplexität von Myelinisierungs-/Remyelinisierungsprozessen und demyelinisierenden Ereignissen macht die Entwicklung prädiktiver In-vitro-Systeme extrem herausfordernd. Die am weitesten verbreiteten In-vitro-Wirkstoff-Screening-Systeme sind meist menschliche Zelllinien oder primäre reine OL-Kulturen, wobei zunehmend komplexere Cokulturen oder organotypische Systeme verwendet werden15. Auch wenn solche Systeme mit High-Content-Technologien gekoppelt sind, bleiben reine OL-Kulturen die Method…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt von MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), und Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Besonderer Dank geht an die IRET Foundation für die Durchführung der experimentellen Arbeit.
Materials
| 96-well plates – untreated | NUNC | 267313 | |
| B27 supplement (100x) | GIBCO | 17504-044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | GIBCO | PHG0024 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ciliary Neurotropic Factor (CNTF) | GIBCO | PHC7015 | |
| DMEM w/o glucose | GIBCO | A14430-01 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX | GIBCO | 31331-028 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| EBSS | GIBCO | 14155-048 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | GIBCO | PHG6045 | |
| HBSS | GIBCO | 14170-088 | |
| HEPES | GIBCO | 15630-056 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| IFN-γ | Origene | TP721239 | |
| IL-17A | Origene | TP723199 | |
| IL-1β | Origene | TP723210 | |
| IL-6 | Origene | TP723240 | |
| laminin | GIBCO | 23017-051 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| N2 supplement (50x) | GIBCO | 17502-048 | |
| Non-enzymatic dissociation buffer | GIBCO | 13150-016 | |
| PBS | GIBCO | 70011-036 | |
| Penicillin / Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Platelet Derived Growth Factor (PDGF-AA) | GIBCO | PHG0035 | |
| poly-D,L-ornitine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| TGF-β1 | Origene | TP720760 | |
| TNF-α | Origene | TP723451 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752-1G | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 |
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