Ensemencement de cellules par étapes sur des échafaudages tessellés pour étudier les vaisseaux sanguins en germination
Summary
Les tissus modifiés s’appuient fortement sur des réseaux vasculaires appropriés pour fournir des nutriments et des gaz vitaux et éliminer les déchets métaboliques. Dans ce travail, un protocole d’ensemencement par étapes de cellules endothéliales et de cellules de soutien crée des réseaux vasculaires hautement organisés dans une plate-forme à haut débit pour étudier le développement du comportement des vaisseaux dans un environnement 3D contrôlé.
Abstract
Le système cardiovasculaire est un acteur clé de la physiologie humaine, fournissant de la nourriture à la plupart des tissus du corps; Les vaisseaux sont présents dans différentes tailles, structures, phénotypes et performances en fonction de chaque tissu perfusé spécifique. Le domaine de l’ingénierie tissulaire, qui vise à réparer ou à remplacer les tissus corporels endommagés ou manquants, repose sur l’angiogenèse contrôlée pour créer une vascularisation appropriée dans les tissus modifiés. Sans système vasculaire, des constructions machinées épaisses ne peuvent pas être suffisamment nourries, qui peuvent avoir comme conséquence la mort cellulaire, la greffe pauvre, et finalement l’échec. Ainsi, comprendre et contrôler le comportement des vaisseaux sanguins modifiés est un défi de taille dans le domaine. Ce travail présente un système à haut débit qui permet la création de réseaux de navires organisés et reproductibles pour étudier le comportement des navires dans un environnement d’échafaudage 3D. Ce protocole d’ensemencement en deux étapes montre que les vaisseaux dans le système réagissent à la topographie de l’échafaudage, présentant des comportements de germination distinctifs en fonction de la géométrie du compartiment dans lequel résident les vaisseaux. Les résultats obtenus et la compréhension de ce système à haut débit peuvent être appliqués afin d’informer de meilleures conceptions de construction d’échafaudages bio-imprimés 3D, dans lesquelles la fabrication de diverses géométries 3D ne peut pas être rapidement évaluée lors de l’utilisation de l’impression 3D comme base pour les environnements biologiques cellulaires. En outre, la compréhension de ce système à haut débit peut être utilisée pour l’amélioration du dépistage rapide des médicaments, le développement rapide de modèles de co-cultures et l’étude des stimuli mécaniques sur la formation des vaisseaux sanguins afin d’approfondir les connaissances sur le système vasculaire.
Introduction
Le domaine de l’ingénierie tissulaire progresse rapidement vers la fabrication de constructions techniques pour remplacer les organes et tissus manquants ou endommagés1. Cependant, des constructions entièrement fonctionnelles n’ont pas encore été réalisées, en partie, puisque la génération de réseaux vasculaires opérationnels pour la nourriture de tissu demeure un défi exceptionnel. Sans vascularisation appropriée, les tissus modifiés sont limités à un transport passif de diffusion de l’oxygène et des nutriments, limitant l’épaisseur maximale des tissus viables à la limite de diffusion, environ 200μm2. De telles épaisseurs ne sont pas adaptées à la réparation de grands défauts tissulaires ou à la fabrication d’organes complets, ce qui rend la présence d’un réseau vasculaire fonctionnel une caractéristique obligatoire pour les tissus fonctionnels et implantables3.
Le système vasculaire est composé d’une grande variété de vaisseaux sanguins, avec différentes tailles, phénotypes, et l’organisation, étroitement liés au tissu de l’hôte. Comprendre le comportement, la réponse et les décisions de migration prises par les vaisseaux en développement et en germination peut instruire leur intégration dans les tissus artificiels4. Actuellement, l’approche la plus courante pour créer des réseaux vasculaires in vitro consiste à combiner des cellules endothéliales (CE) avec des cellules de soutien (SC, avec la capacité de se différencier en cellules murales), ensemencées dans un microenchantement tridimensionnel. Cet environnement fournit des indices chimiques et physiques pour permettre aux cellules de se fixer, de proliférer et de s’auto-assembler en réseaux de vaisseaux2,5,6,7,8. Lorsqu’ils sont en co-culture, les SC sécrètent des protéines de matrice extracellulaire (ECM) tout en fournissant un soutien mécanique aux CE, qui forment les structures tubulaires. En outre, une interaction croisée entre les deux types de cellules favorise la tubulogenèse, la germination des vaisseaux et la migration, en plus de la maturation et de la différenciation des SC en cellules murales exprimant l’actine α-lisse (αSMA)4. Le développement de réseaux de vaisseaux est le plus souvent étudié dans des environnements 3D créés à l’aide d’hydrogels, d’échafaudages polymères poreux ou d’une combinaison de ceux-ci. Cette dernière option fournit également un environnement convivial pour les cellules et le support mécanique requis pour les cellules et l’ECM9.
Un grand nombre de travaux ont été réalisés pour étudier le développement vasculaire, notamment la co-culture des cellules sur les hydrogels10,les combinaisons hydrogels-échafaudages11,12,les plateformes 2D, et les dispositifs microfluidiques13. Cependant, les hydrogels peuvent être facilement déformés par les forces exercées par les cellules14,tandis que les systèmes 2D et microfluidiques ne parviennent pas à recréer un environnement plus proche de la nature pour obtenir une réponse plus extrapolable15,16. Comprendre comment les navires formants réagissent à leur environnement environnant peut fournir des informations essentielles qui pourraient permettre la fabrication d’environnements techniques ayant la capacité de guider le développement des navires de manière prévisible. La compréhension des phénomènes de formation vasculaire est particulièrement essentielle pour suivre le rythme de l’émergence rapide des techniques de fabrication à l’échelle submicron-micron, telles que la stéréolithographie, la lithographie par projection numérique, la production continue d’interfaces liquides, l’électroécriture 3D 3D, l’écriture électro jet 3D basée sur une solution et les techniques émergentes de bioimpression17,18,19,20,21. L’alignement du contrôle de ces techniques de microfabrication avec une compréhension approfondie de la biologie vasculaire est essentiel à la création d’une vascularisation artificielle appropriée pour un tissu cible.
Ici, nous présentons un système 3D pour étudier la réponse des nouveaux vaisseaux de formation et de germination à la géométrie de l’échafaudage environnant, en observant leur origine de germination et la migration ultérieure22. En utilisant des échafaudages 3D avec des géométries de compartiments pavés et une technique d’ensemencement en deux étapes, nous avons réussi à créer des réseaux vasculaires hautement organisés d’une manière claire et facile à analyser. Les géométries pavées fournissent un système à haut débit avec des unités individuelles contenant des navires qui répondent à leur environnement local. À l’aide de CE multicolores, nous avons suivi les origines de la formation des germes et les modèles de migration subséquents, corrélés à la géométrie du compartiment et à l’emplacement des SC22.
Bien que le protocole proposé ait été préparé pour analyser les effets des indices géométriques sur le comportement de vascularisation, cette approche peut être augmentée et appliquée à une série de nouvelles applications. L’échafaudage pavé et les réseaux facilement imageables permettent l’analyse simple de différentes interactions entre les CE et les SC, l’ajout de cellules d’organes spécifiques et leur interaction avec les réseaux vasculaires, l’effet médicamenteux sur les réseaux vasculaires, et plus encore. Nos résultats de système suggérés très polyvalents et de fabrication et de traitement simples.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nécessité d’une vascularisation riche dans les tissus incorporés dans les tissus artificiels est essentielle pour la survie de la construction et la bonne fonction1. Bien que l’ingénierie du système vasculaire ait fait l’objet d’une grande quantité de recherches, il reste beaucoup à étudier et à comprendre24. En particulier, lors de la recréation d’un tissu spécifique, la microvasculature doit se comporter et s’organiser en conséquence<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Partenariat Université du Michigan – Israël pour la recherche. Les auteurs tiennent à remercier Uri Merdler, Lior Debbi et Galia Ben David pour leur aide et leur soutien, Nadine Wang, Ph.D. et Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. de l’installation de nanofabrication Lurie de l’Université du Michigan, ainsi que Luis Solorio, Ph.D. pour des discussions éclairantes sur les techniques de photolithographie.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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