Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße
Summary
Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.
Abstract
Das Herz-Kreislauf-System ist ein Wichtiger Akteur in der menschlichen Physiologie und versorgt die meisten Gewebe im Körper mit Nahrung. Gefäße sind in verschiedenen Größen, Strukturen, Phänotypen und Leistung vorhanden, abhängig von jedem spezifischen durchbluteten Gewebe. Das Gebiet des Tissue Engineering, das darauf abzielt, beschädigtes oder fehlendes Körpergewebe zu reparieren oder zu ersetzen, stützt sich auf eine kontrollierte Angiogenese, um eine ordnungsgemäße Vaskularisierung innerhalb der künstlichen Gewebe zu schaffen. Ohne ein Gefäßsystem können dicke konstruierte Konstrukte nicht ausreichend genährt werden, was zu Zelltod, schlechter Transplantation und letztendlich zum Versagen führen kann. Daher ist das Verständnis und die Kontrolle des Verhaltens von künstlichen Blutgefäßen eine herausragende Herausforderung auf diesem Gebiet. Diese Arbeit stellt ein Hochdurchsatzsystem vor, das die Erstellung organisierter und wiederholbarer Schiffsnetzwerke zur Untersuchung des Schiffsverhaltens in einer 3D-Gerüstumgebung ermöglicht. Dieses zweistufige Seeding-Protokoll zeigt, dass Gefäße innerhalb des Systems auf die Gerüsttopographie reagieren und je nach Kompartimentgeometrie, in der sich die Gefäße befinden, ein ausgeprägtes Keimverhalten aufweisen. Die erhaltenen Ergebnisse und das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems können angewendet werden, um bessere 3D-biogedruckte Gerüstkonstruktionsentwürfe zu erstellen, wobei die Herstellung verschiedener 3D-Geometrien nicht schnell bewertet werden kann, wenn der 3D-Druck als Grundlage für zellularisierte biologische Umgebungen verwendet wird. Darüber hinaus kann das Verständnis dieses Hochdurchsatzsystems für die Verbesserung des schnellen Wirkstoffscreenings, die schnelle Entwicklung von Co-Cultures-Modellen und die Untersuchung mechanischer Reize auf die Blutgefäßbildung genutzt werden, um das Wissen über das Gefäßsystem zu vertiefen.
Introduction
Das Gebiet des Tissue Engineering schreitet schnell voran in Richtung der Herstellung von technischen Konstrukten, um fehlende oder beschädigte Organe und Gewebe zu ersetzen1. Voll funktionsfähige Konstrukte müssen jedoch teilweise noch erreicht werden, da die Erzeugung operativer vaskulärer Netzwerke für die Gewebeernährung eine herausragende Herausforderung bleibt. Ohne richtige Vaskularisierung sind künstliche Gewebe auf einen passiven Diffusionstransport von Sauerstoff und Nährstoffen beschränkt, wodurch die maximale lebensfähige Gewebedicke auf die Diffusionsgrenze von etwa 200 μm2beschränkt wird. Solche Dicken sind nicht geeignet, um große Gewebedefekte zu reparieren oder für die vollständige Organherstellung, was das Vorhandensein eines funktionellen Gefäßnetzwerks zu einem obligatorischen Merkmal für funktionelle und implantierbare Gewebe macht3.
Das Gefäßsystem besteht aus einer Vielzahl von Blutgefäßen mit unterschiedlichen Größen, Phänotypen und Organisationen, die eng mit dem Wirtsgewebe verbunden sind. Das Verständnis des Verhaltens, der Reaktion und der Migrationsentscheidungen, die von den sich entwickelnden und sprießenden Gefäßen getroffen werden, kann ihre Integration in künstliche Gewebe anweisen4. Derzeit ist der gebräuchlichste Ansatz zur Schaffung von In-vitro-Gefäßnetzwerken die Kombination von Endothelzellen (ECs) mit Unterstützungszellen (SCs, mit der Fähigkeit, sich zu Wandzellen zu differenzieren), die in einer dreidimensionalen Mikroumgebung ausgesät sind. Diese Umgebung liefert chemische und physikalische Hinweise, damit sich die Zellen an Gefäßnetzwerke anheften, vermehren und selbst zu Gefäßnetzwerken zusammensetzenkönnen 2,5,6,7,8. Wenn sie co-kultiviert werden, sezernieren SCs extrazelluläre Matrixproteine (ECM) und bieten gleichzeitig mechanische Unterstützung für die ECs, die die röhrenförmigen Strukturen bilden. Darüber hinaus fördert eine Kreuzinteraktion zwischen beiden Zelltypen tubulogenese, Gefäßkeimung und Migration, zusätzlich zur SCs Reifung und Differenzierung in α-glatte Muskel-Aktin-exprimierende (αSMA) Wandzellen4. Die Entwicklung von Gefäßnetzwerken wird am häufigsten in 3D-Umgebungen untersucht, die mit Hydrogelen, porösen polymeren Gerüsten oder einer Kombination davon erstellt wurden. Letztere Option bietet gleichermaßen eine zellfreundliche Umgebung und die erforderliche mechanische Unterstützung sowohl für die Zellen als auch für das ECM9.
Es wurde eine große Menge an Arbeiten durchgeführt, um die vaskuläre Entwicklung zu untersuchen, einschließlich der Co-Kultivierung der Zellen auf Hydrogelen10,Hydrogelen-Gerüst-Kombinationen11,12, 2D-Plattformen und mikrofluidischen Geräten13. Hydrogele können jedoch leicht durch die von der Zelle ausgeübten Kräfte14deformiert werden, während 2D- und Mikrofluidiksysteme es nicht schaffen, eine naturnähere Umgebung nachzubilden, um eine extrapolierbarere Antwort zu erhalten15,16. Zu verstehen, wie umformende Gefäße auf ihre Umgebung reagieren, kann wichtige Einblicke liefern, die die Herstellung von technischen Umgebungen mit der Fähigkeit ermöglichen, die Schiffsentwicklung auf vorhersehbare Weise zu leiten. Das Verständnis von Gefäßbildungsphänomenen ist besonders wichtig, um mit dem schnellen Aufkommen von Fertigungstechniken im Submikron-zu-Mikron-Maßstab Schritt zu halten, wie Stereolithographie, digitale Projektionslithographie, kontinuierliche Flüssigschnittstellenproduktion, 3D-Schmelzelektro-Jetwriting, lösungsbasiertes 3D-Elektrojet-Schreiben und aufkommende Bioprinting-Techniken17,18,19,20,21. Die Kontrolle dieser Mikroherstellungstechniken mit einem vertieften Verständnis der vaskulären Biologie in Einklang zu bringen, ist der Schlüssel zur Schaffung eines geeigneten künstlichen Gefäßsystems für ein Zielgewebe.
Hier stellen wir ein 3D-System vor, um die Reaktion neuer sich bildender und keimender Gefäße auf die umgebende Gerüstgeometrie zu untersuchen und deren Keimursprung und anschließende Migration zu beobachten22. Durch die Verwendung von 3D-Gerüsten mit tessellierten Kompartimentgeometrien und einer zweistufigen Seeding-Technik ist es uns gelungen, hochorganisierte vaskuläre Netzwerke auf klare und einfach zu analysierende Weise zu erstellen. Die tessellierten Geometrien bieten ein System mit hohem Durchsatz mit einzelnen Einheiten, die Behälter enthalten, die auf ihre lokale Umgebung reagieren. Mit mehrfarbigen ECs verfolgten wir die Ursprünge der Sprossenbildung und nachfolgende Migrationsmuster, korreliert mit der Kompartimentgeometrie und der SCs-Position22.
Obwohl das vorgeschlagene Protokoll vorbereitet wurde, um die Auswirkungen geometrischer Hinweise auf das Vaskularisierungsverhalten zu analysieren, kann dieser Ansatz erweitert und auf eine Vielzahl neuer Anwendungen angewendet werden. Das tessellierte Gerüst und die leicht abbildbaren Netzwerke ermöglichen die einfache Analyse verschiedener ECs- und SCs-Interaktionen, die Addition spezifischer Organzellen und deren Interaktion mit den vaskulären Netzwerken, die Arzneimittelwirkung auf vaskuläre Netzwerke und vieles mehr. Unser vorgeschlagenes System ist sehr vielseitig und einfach herzustellen und zu verarbeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Notwendigkeit eines reichen Gefäßes, das in künstliche Gewebe eingebettet ist, ist entscheidend für das Überleben des Konstrukts und die ordnungsgemäße Funktion1. Obwohl die Entwicklung des Gefäßsystems im Mittelpunkt einer großen Menge an Forschung stand, bleibt noch viel zu untersuchen und zu verstehen24. Insbesondere bei der Nachbildung eines bestimmten Gewebes sollte sich die Mikrovaskulatur entsprechend verhalten und organisieren12…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Mittel der University of Michigan – Israel Partnership for Research unterstützt. Die Autoren danken Uri Merdler, Lior Debbi und Galia Ben David für ihre große Unterstützung und Unterstützung, Nadine Wang, Ph.D. und Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. der Lurie Nanofabrication Facility an der University of Michigan, sowie Luis Solorio, Ph.D. für aufschlussreiche Diskussionen über Photolithographietechniken.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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