Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando
Summary
Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.
Abstract
O sistema cardiovascular é um ator-chave na fisiologia humana, proporcionando nutrição à maioria dos tecidos do corpo; os vasos estão presentes em diferentes tamanhos, estruturas, fenótipos e desempenho, dependendo de cada tecido perfumado específico. O campo da engenharia de tecidos, que visa reparar ou substituir tecidos corporais danificados ou ausentes, conta com angiogênese controlada para criar uma vascularização adequada dentro dos tecidos projetados. Sem um sistema vascular, construções grossas projetadas não podem ser suficientemente nutridas, o que pode resultar em morte celular, má engrafia e, finalmente, falha. Assim, compreender e controlar o comportamento dos vasos sanguíneos projetados é um desafio marcante no campo. Este trabalho apresenta um sistema de alta produtividade que permite a criação de redes de embarcações organizadas e repetíveis para estudar o comportamento dos navios em um ambiente de andaime 3D. Este protocolo de semeadura em duas etapas mostra que os vasos dentro do sistema reagem à topografia do andaime, apresentando comportamentos distintos de brotação dependendo da geometria do compartimento em que os vasos residem. Os resultados obtidos e a compreensão deste sistema de alto rendimento podem ser aplicados a fim de informar melhores projetos de construção de andaimes bioimpressos 3D, onde a fabricação de várias geometrias 3D não pode ser rapidamente avaliada ao usar a impressão 3D como base para ambientes biológicos celularizados. Além disso, o entendimento deste sistema de alto rendimento pode ser utilizado para a melhoria do rastreamento rápido de medicamentos, o rápido desenvolvimento de modelos de co-culturas e a investigação de estímulos mecânicos na formação de vasos sanguíneos para aprofundar o conhecimento do sistema vascular.
Introduction
O campo da engenharia de tecidos está progredindo rapidamente para a fabricação de construtos projetados para substituir órgãos e tecidos perdidos ou danificados1. No entanto, construções totalmente funcionais ainda não foram alcançadas, em parte, uma vez que a geração de redes vasculares operacionais para nutrição tecidual continua sendo um desafio notável. Sem a vascularização adequada, os tecidos projetados limitam-se a um transporte passivo de difusão de oxigênio e nutrientes, restringindo a espessura máxima do tecido viável ao limite de difusão, aproximadamente 200 μm2. Tais espessuras não são adequadas para reparar grandes defeitos teciduais ou para a fabricação completa de órgãos, o que torna a presença da rede vascular funcional uma característica obrigatória para tecidos funcionais e implantáveis3.
O sistema vascular é composto por uma grande variedade de vasos sanguíneos, com diferentes tamanhos, fenótipos e organização, fortemente relacionados ao tecido hospedeiro. Compreender o comportamento, a resposta e as decisões migratórias tomadas pelos vasos em desenvolvimento e brotação pode instruir sua integração nos tecidos projetados4. Atualmente, a abordagem mais comum para a criação de redes vasculares in vitro é combinar células endoteliais (CE) com células de suporte (SCs, com a capacidade de diferenciar-se em células murais), semeadas dentro de um microambique tridimensional. Este ambiente fornece pistas químicas e físicas para permitir que as células se conectem, proliferem e se auto-reúnam nas redes de vasos2,5,6,7,8. Quando co-cultivados, os SCs secretam proteínas de matriz extracelular (ECM) ao mesmo tempo em que fornecem suporte mecânico às CES, que formam as estruturas tubulares. Além disso, uma interação cruzada entre ambos os tipos de células promove a tubulogênese, o broto de vasos e a migração, além da maturação e diferenciação dos SCs em células murais de α-suave actin-expressing (αSMA)4. O desenvolvimento da rede de navios é mais comumente estudado em ambientes 3D criados com hidrogel, andaimes poliméricos porosos ou uma combinação disso. Esta última opção também fornece um ambiente amigável às células e o suporte mecânico necessário tanto para as células quanto para o ECM9.
Uma grande quantidade de trabalho tem sido realizada para estudar o desenvolvimento vascular, incluindo co-cultivo das células em hidrogéis10,combinações de hidrogels-andaimes11,12,plataformas 2D e dispositivos microfluidos13. No entanto, os hidrogéis podem ser facilmente deformados pelas forças14,enquanto os sistemas 2D e microfluidos não conseguem recriar um ambiente mais próximo da natureza para obter uma resposta mais extrapolada15,16. Entender como os navios formadores reagem ao seu ambiente circundante pode fornecer uma visão crítica que pode permitir a fabricação de ambientes projetados com a capacidade de orientar o desenvolvimento da embarcação de forma previsível. Compreender fenômenos de formação vascular é especialmente fundamental para acompanhar o rápido surgimento de técnicas de fabricação em escala submicron-micron, como estereografografia, litografia de projeção digital, produção contínua de interface líquida, jetwriting 3D, escrita de jato eletro 3D baseada em solução e técnicas emergentes de bioimpressão17,18,19,20,21. Alinhar o controle dessas técnicas de micromanufatura com uma compreensão aprofundada da biologia vascular é fundamental para a criação de uma vasculatura projetada adequada para um tecido alvo.
Aqui, apresentamos um sistema 3D para estudar a resposta de novos vasos formadores e brotantes à geometria do andaime circundante, observando sua origem do broto e migração subsequente22. Utilizando andaimes 3D com geometrias de compartimento tesvendadas, e uma técnica de semeadura em duas etapas, conseguimos criar redes vasculares altamente organizadas de forma clara e fácil de analisar. As geometrias tessellated fornecem um sistema de alta produção com unidades individuais contendo embarcações que respondem ao seu ambiente local. Utilizando ECs multicoloridos, rastreamos origens de formação de brotos e padrões de migração subsequentes, correlacionados à geometria do compartimento e à localização22dos SCs .
Embora o protocolo proposto tenha sido preparado para analisar os efeitos das pistas geométricas sobre o comportamento vascularização, essa abordagem pode ser expandida e aplicada a uma variedade de novas aplicações. O andaime tessellado e as redes facilmente inflamáveis permitem a análise direta de diferentes CEs e interação de SCs, a adição de células específicas de órgãos e sua interação com as redes vasculares, efeito medicamentoso nas redes vasculares e muito mais. Nosso sistema sugerido resulta muito versátil e de simples fabricação e processamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A necessidade de uma vasculatura rica dentro de tecidos projetados é fundamental para a sobrevivência da construção e função adequada1. Embora a engenharia do sistema vascular tenha sido o foco de uma vasta quantidade de pesquisas, muito resta investigar e entender24. Em particular, ao recriar um tecido específico, a microvasculatura deve se comportar e organizar-se nesse ponto12. A abordagem mais comum para a geração de microvessels é a co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por financiamento da Universidade de Michigan – Israel Partnership for Research. Os autores gostariam de agradecer a Uri Merdler, Lior Debbi e Galia Ben David por sua grande ajuda e apoio, Nadine Wang, Ph.D. e Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. da Lurie Nanofabrication Facility na Universidade de Michigan, bem como Luis Solorio, Ph.D. para esclarecer discussões de técnicas de fotoliografia.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
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