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Bioengineering

Modèle microfluidique pour imiter l'événement initial de la néovascularisation

Published: April 10, 2021
doi:
10.3791/62003
, , , , , , , ,
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering,Beihang University, 2School of Engineering Medicine,Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering,Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Summary

Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d’être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).

Abstract

La néovascularisation est habituellement paraphée à partir d’une vascularisation normale existante et le microenvironnement biomécanique des cellules endothéliales (CE) à l’étape initiale varie considérablement du processus suivant de néovascularisation. Bien qu’il existe de nombreux modèles pour simuler les différentes étapes de la néovascularisation, un modèle 3D in vitro qui capitule le processus initial de néovascularisation sous les stimulations correspondantes des microenvironnements vasculature normale fait encore défaut. Ici, nous avons reconstruit un modèle 3D in vitro qui imite l’événement initial de la néovascularisation (MIEN). Le modèle MIEN contient une puce de germination microfluidique et un système de circulation automatique et très efficace. Un microcanal fonctionnel et perfusable recouvert d’endothélium a été formé et le processus de germination a été simulé dans la puce de germination microfluidique. Le microenvironnement initialement physiologique de la néovascularisation a été récapitulé avec le système de contrôle microfluidique, par lequel les CE seraient exposés à l’effort élevé de cisaillement luminal, au flux transendothelial physiologique, et à diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale (VEGF) simultanément. Le modèle MIEN peut être facilement appliqué à l’étude du mécanisme de néovascularisation et détient une promesse potentielle en tant que plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.

Introduction

La néovascularisation se produit dans de nombreux processus normaux et pathologiques1,2,3,4, qui comprennent deux processus majeurs chez les adultes, l’angiogenèse et l’artériogenèse5. Outre les facteurs de croissance les plus connus, tels que le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF)6, les stimulations mécaniques, en particulier le stress de cisaillement induit par le flux sanguin, est important dans la régulation de la néovascularisation7. Comme nous le savons, l’ampleur et les formes de stress de cisaillement varient considérablement et dynamiquement dans différentes parties de la vascularisation, entraînant des effets importants sur les cellulesvasculaires 8,9,10,11,12. Des études antérieures ont montré que le stress du cisaillement peut affecter divers aspects des CE, y compris les changements phénotypiques cellulaires, la transduction du signal, l’expression des gènes et la communicationavec les cellules murales 13,14,15,16,17,18,19,20; par conséquent, réglementer la néovascularisation21,22,23,24.

Par conséquent, pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Récemment, de nombreux modèles ont été mis en place pour créer des micro-navires et fournir un contrôle précis du microenvironnement25,26,27, en profitant des progrès de la microfabrication et de la technologie microfluidique. Dans ces modèles, les micro-navires peuvent être générés par hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques30,31,32 ou bioimpression 3D33,34. Certains aspects du microenvironnement, tels que le stress de cisaillement luminal22,23,35,36, flux transendothelial37,38,39,40, gradient biochimique des facteurs angiogéniques41,42, souche / étirement43,44,45, et co-cultivé avec d’autres types de cellules32,46 ont été imités et contrôlés. Habituellement, un grand réservoir ou une pompe à seringues était utilisé pour fournir un milieu perfusé. Le flux transendothelial dans ces modèles a été créé par la baisse de pression entre le réservoir et le micro-tube22,23,38,40. Cependant, le microenvironnement mécanique était difficile à maintenir constamment de cette façon. Le débit transendothelial augmenterait et dépasserait alors le niveau physiologique si un taux d’écoulement élevé avec le stress élevé de cisaillement a été employé pour la perfusion. L’étude précédente a prouvé qu’à la période initiale de la néovascularisation, la vitesse du flux transendothelial est très basse en raison des CE intacts et de la membrane de sous-sol, habituellement sous 0.05 μm/s8. Pendant ce temps, bien que le stress de cisaillement luminal dans le système vasculaire varie considérablement, il est relativement élevé avec des valeurs moyennes de 5-20 dyn/cm2,11,47. Pour l’instant, la vitesse du flux transendothelial dans les travaux précédents ont été généralement maintenus entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, et le stress de cisaillement luminal était généralement inférieure à 10 dyn/cm2 23. Il reste un sujet difficile d’exposer constamment les CE à l’effort de cisaillement luminal élevé et au niveau physiologique du flux transendothelial simultanément.

Dans la présente étude, nous décrivons un modèle 3D in vitro pour imiter l’événement initial de la néovascularisation (MIEN). Nous avons développé une puce microfluidique et un système de circulation automatique, très efficace pour former des micro-tubes de perfusion et simuler le processus de germination48. Avec le modèle MIEN, le microenvironnement des CE stimulé à la période initiale de néovascularisation est d’abord récapitulé. Les CE peuvent être stimulés par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions de VEGF simultanément. Nous décrivons en détail les étapes de l’établissement du modèle MIEN et les points clés à prendre en compte, dans l’espoir de fournir une référence à d’autres chercheurs.

Protocol

1. Préparation des gaufrettes REMARQUE : Ce protocole est spécifique pour le photorésiste négatif SU-8 2075 utilisé au cours de cette recherche. Nettoyez la plaquette de silicium 3 à 5 fois avec du méthanol et de l’isopropanol sur un revêtement de spin comme suit : d’abord tourner pendant 15 s à 500 rpm, puis tourner pendant 60 s à 3 000 tours. Transférer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante, préchauffée à 180 °C et cuire la gaufrette pendant 10…

Representative Results

Le modèle 3D in vitro pour imiter l’événement initial de néovascularisation (MIEN) présenté ici se composait d’une puce de germination microfluidique et d’un système de contrôle microfluidique. La puce de germination microfluidique a été optimisée à partir des publicationsprécédentes 22,23,37,40,51,52<s…

Discussion

Pendant longtemps, l’observation en temps réel de la néovascularisation a été un problème. Plusieurs approches ont été développées récemment pour créer des vaisseaux perfusés tapissant avec des CE et adjacents à la matrice extracellulairepour germer 22,32,40,46,54, mais le microenvironnement mécanique est encore difficile à maintenir constamment…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été appuyés par la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvention nos 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 et 32071311), Programme national clé de recherche et développement de la Chine (subvention nos 2016YFC1101101 et 2016YFC1102202), le projet 111 (B13003), et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (4194079).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA Genview GP3108
Collagen I, rat tail Corning 354236
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Electromagnetic pinch valve Wokun Technology WK02-308-1/3
Endothelial cell medium (ECM) Sciencell 1001
Fetal bovine serum (FBS) Every Green NA
Fibronectin Corning 354008
FITC-dextran Miragen 60842-46-8
Graphical programming environment Lab VIEW NA
Image editing software PhotoShop NA
Image processing program ImageJ NA
Isopropanol Sigma-Aldrich 91237
Lithography equipment Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences URE-2000/35
Methanol Sigma-Aldrich 82762
Micro-peristaltic pump Lead Fluid BT101L
Micro-syringe pump Lead Fluid TYD01
Oxygen plasma MING HENG PDC-MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS (10x) Beyotime ST448
Permanent epoxy negative photoresist Microchem SU-8 2075
Phenol Red sodium salt Sigma-Aldrich P5530
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P7886
Polytetrafluoroethylene Teflon NA
Program software MATLAB NA
Recombinant Human VEGF-165 StemImmune LLC HVG-VF5
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 1.06498
Stage top incubator Tokai Hit NA
SU-8 developer Microchem NA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931
TRITC Phalloidin Sigma-Aldrich P5285
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References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261 (1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249 (2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209 (2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869 (2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56 (2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737 (2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880 (2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092 (2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657 (2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046 (2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863 (2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial “vessels” for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64 (2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443 (2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), 188 (1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

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Zhao, P., Zhang, X., Liu, X., Wang, L., Su, H., Wang, L., Zhang, D., Deng, X., Fan, Y. Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization. J. Vis. Exp. (170), e62003, doi:10.3791/62003 (2021).
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