Ici, nous fournissons une puce microfluidique et un système microfluidique de circulation automatiquement contrôlé et très efficace qui récapitule le microenvironnement initial de la néovascularisation, permettant aux cellules endothéliales (CE) d’être stimulées simultanément par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions simultanées du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF).
La néovascularisation est habituellement paraphée à partir d’une vascularisation normale existante et le microenvironnement biomécanique des cellules endothéliales (CE) à l’étape initiale varie considérablement du processus suivant de néovascularisation. Bien qu’il existe de nombreux modèles pour simuler les différentes étapes de la néovascularisation, un modèle 3D in vitro qui capitule le processus initial de néovascularisation sous les stimulations correspondantes des microenvironnements vasculature normale fait encore défaut. Ici, nous avons reconstruit un modèle 3D in vitro qui imite l’événement initial de la néovascularisation (MIEN). Le modèle MIEN contient une puce de germination microfluidique et un système de circulation automatique et très efficace. Un microcanal fonctionnel et perfusable recouvert d’endothélium a été formé et le processus de germination a été simulé dans la puce de germination microfluidique. Le microenvironnement initialement physiologique de la néovascularisation a été récapitulé avec le système de contrôle microfluidique, par lequel les CE seraient exposés à l’effort élevé de cisaillement luminal, au flux transendothelial physiologique, et à diverses distributions vasculaires de facteur de croissance endothéliale (VEGF) simultanément. Le modèle MIEN peut être facilement appliqué à l’étude du mécanisme de néovascularisation et détient une promesse potentielle en tant que plate-forme à faible coût pour le dépistage des médicaments et les applications toxicologiques.
La néovascularisation se produit dans de nombreux processus normaux et pathologiques1,2,3,4, qui comprennent deux processus majeurs chez les adultes, l’angiogenèse et l’artériogenèse5. Outre les facteurs de croissance les plus connus, tels que le facteur vasculaire de croissance endothéliale (VEGF)6, les stimulations mécaniques, en particulier le stress de cisaillement induit par le flux sanguin, est important dans la régulation de la néovascularisation7. Comme nous le savons, l’ampleur et les formes de stress de cisaillement varient considérablement et dynamiquement dans différentes parties de la vascularisation, entraînant des effets importants sur les cellulesvasculaires 8,9,10,11,12. Des études antérieures ont montré que le stress du cisaillement peut affecter divers aspects des CE, y compris les changements phénotypiques cellulaires, la transduction du signal, l’expression des gènes et la communicationavec les cellules murales 13,14,15,16,17,18,19,20; par conséquent, réglementer la néovascularisation21,22,23,24.
Par conséquent, pour mieux comprendre la néovascularisation, il est important de reconstruire le processus en microenvironnement cellulaire naturel in vitro. Récemment, de nombreux modèles ont été mis en place pour créer des micro-navires et fournir un contrôle précis du microenvironnement25,26,27, en profitant des progrès de la microfabrication et de la technologie microfluidique. Dans ces modèles, les micro-navires peuvent être générés par hydrogel28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques30,31,32 ou bioimpression 3D33,34. Certains aspects du microenvironnement, tels que le stress de cisaillement luminal22,23,35,36, flux transendothelial37,38,39,40, gradient biochimique des facteurs angiogéniques41,42, souche / étirement43,44,45, et co-cultivé avec d’autres types de cellules32,46 ont été imités et contrôlés. Habituellement, un grand réservoir ou une pompe à seringues était utilisé pour fournir un milieu perfusé. Le flux transendothelial dans ces modèles a été créé par la baisse de pression entre le réservoir et le micro-tube22,23,38,40. Cependant, le microenvironnement mécanique était difficile à maintenir constamment de cette façon. Le débit transendothelial augmenterait et dépasserait alors le niveau physiologique si un taux d’écoulement élevé avec le stress élevé de cisaillement a été employé pour la perfusion. L’étude précédente a prouvé qu’à la période initiale de la néovascularisation, la vitesse du flux transendothelial est très basse en raison des CE intacts et de la membrane de sous-sol, habituellement sous 0.05 μm/s8. Pendant ce temps, bien que le stress de cisaillement luminal dans le système vasculaire varie considérablement, il est relativement élevé avec des valeurs moyennes de 5-20 dyn/cm2,11,47. Pour l’instant, la vitesse du flux transendothelial dans les travaux précédents ont été généralement maintenus entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, et le stress de cisaillement luminal était généralement inférieure à 10 dyn/cm2 23. Il reste un sujet difficile d’exposer constamment les CE à l’effort de cisaillement luminal élevé et au niveau physiologique du flux transendothelial simultanément.
Dans la présente étude, nous décrivons un modèle 3D in vitro pour imiter l’événement initial de la néovascularisation (MIEN). Nous avons développé une puce microfluidique et un système de circulation automatique, très efficace pour former des micro-tubes de perfusion et simuler le processus de germination48. Avec le modèle MIEN, le microenvironnement des CE stimulé à la période initiale de néovascularisation est d’abord récapitulé. Les CE peuvent être stimulés par un stress de cisaillement luminal élevé, un niveau physiologique de flux transendothelial et diverses distributions de VEGF simultanément. Nous décrivons en détail les étapes de l’établissement du modèle MIEN et les points clés à prendre en compte, dans l’espoir de fournir une référence à d’autres chercheurs.
Pendant longtemps, l’observation en temps réel de la néovascularisation a été un problème. Plusieurs approches ont été développées récemment pour créer des vaisseaux perfusés tapissant avec des CE et adjacents à la matrice extracellulairepour germer 22,32,40,46,54, mais le microenvironnement mécanique est encore difficile à maintenir constamment…
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux ont été appuyés par la National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (subvention nos 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 et 32071311), Programme national clé de recherche et développement de la Chine (subvention nos 2016YFC1101101 et 2016YFC1102202), le projet 111 (B13003), et la Fondation des sciences naturelles de Beijing (4194079).
0.25% Trypsin-EDTA | Genview | GP3108 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Electromagnetic pinch valve | Wokun Technology | WK02-308-1/3 | |
Endothelial cell medium (ECM) | Sciencell | 1001 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Every Green | NA | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
FITC-dextran | Miragen | 60842-46-8 | |
Graphical programming environment | Lab VIEW | NA | |
Image editing software | PhotoShop | NA | |
Image processing program | ImageJ | NA | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 91237 | |
Lithography equipment | Institute of optics and electronics, Chinese academy of sciences | URE-2000/35 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 82762 | |
Micro-peristaltic pump | Lead Fluid | BT101L | |
Micro-syringe pump | Lead Fluid | TYD01 | |
Oxygen plasma | MING HENG | PDC-MG | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
PBS (10x) | Beyotime | ST448 | |
Permanent epoxy negative photoresist | Microchem | SU-8 2075 | |
Phenol Red sodium salt | Sigma-Aldrich | P5530 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P7886 | |
Polytetrafluoroethylene | Teflon | NA | |
Program software | MATLAB | NA | |
Recombinant Human VEGF-165 | StemImmune LLC | HVG-VF5 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1.06498 | |
Stage top incubator | Tokai Hit | NA | |
SU-8 developer | Microchem | NA | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P5285 |