نحن نصف بروتوكولا لإعادة برمجة الخلايا الليفية المشتقة من الجلد البشري إلى خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) ، وتمايزها اللاحق إلى خلايا أستراتية مستحثة (iAs). وتؤدي هذه الطريقة إلى توليد سريع وقابل للاستنساخ من الشخصيات غير الوطنية وأجهزة iAs بكميات كبيرة.
تركز الأبحاث على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على تأثير الخلايا العصبية على آليات المرض. يؤثر التوافر المحدود للنماذج الحيوانية تأثيرا شديدا على دراسة مساهمات محددة لنوع الخلية في المرض. وعلاوة على ذلك، فإن النماذج الحيوانية عادة لا تعكس التباين في الطفرات ودورات الأمراض التي ينظر إليها في المرضى البشر. أحدثت طرق إعادة البرمجة لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ثورة في أبحاث المريض المحددة وخلقت أدوات قيمة لدراسة آليات المرض. ومع ذلك ، فإن تقنية iPSC لها عيوب مثل الوقت والالتزام بالعمل والانتقائية اللاستنساخية وفقدان العلامات اللاجينية. تسمح التعديلات الأخيرة لهذه الطرق بتوليد أكثر مباشرة من أنساب الخلايا أو أنواع خلايا محددة ، متجاوزة العزلة اللاستنساخية أو حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لقد طورنا طريقة تحويل مباشرة سريعة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة (iNPCs) من الخلايا الليفية الجلدية باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية في تركيبة مع وسائل الإعلام العصبية. يمكن تمييز ال INPCs إلى خلايا عصبية (iNs) أوليغودندروسيتوس (iOs) والخلايا الفلكية (iAs). ويسهل إنتاج اتفاقات مكافحة المخدرات إجراء اختبار سريع لآلية المخدرات والأمراض لأن التمايز عن الشخصيات غير الوطنية لا يستغرق سوى 5 أيام. وعلاوة على ذلك، من السهل العمل مع اتفاقات الاستثمار الدولية ويتم إنشاؤها في مجموعات سكانية نقية بأعداد كبيرة. قمنا بتطوير اختبار الثقافة المشتركة القابلة للاستنساخ للغاية باستخدام الخلايا العصبية GFP + الماوس و iAs المشتقة من المريض لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. الأهم من ذلك ، فإن مقايسات iA قابلة للتطوير إلى تنسيق 384 جيدا مما يسهل تقييم جزيئات صغيرة متعددة في لوحة واحدة. يسمح هذا النهج بإجراء تقييم علاجي متزامن لخطوط خلايا المريض المتعددة ذات الخلفية الوراثية المتنوعة. سهولة إنتاج وتخزين iAs والقدرة على فحص مركبات متعددة في مقايسة واحدة يجعل هذه المنهجية قابلة للتكيف مع الطب الشخصي.
فهم آليات الأمراض الكامنة أمر بالغ الأهمية للأمراض العصبية لأنه يساعد في وضع استراتيجيات علاجية محتملة. في حين أن النماذج الحيوانية تاريخيا كانت المعيار الذهبي للبحث في أمراض الجهاز العصبي ، فإن الترجمة المباشرة للعلاجات المحتملة إلى بيئة سريرية غالبا ما تظهر نجاحا محدودا1و2و3. أسباب عدم وجود الترجمة هي عدم وجود تباين في الخلفية الوراثية والطفرات في الفئران ، والعرض غير الكامل للأنماط الظاهرية للمرض والاختلاف في حساسية الدواء أو التعاطي في المرضى البشريين التي لا يتم تصويرها بشكل جيد في سلالات الفئران الأصيلة. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للعديد من الاضطرابات العصبية النادرة، لا تتوفر نماذج حيوانية أو عدد قليل منها. دراسة آليات المرض مباشرة في أنواع الخلايا البشرية ذات الصلة يمكن أن تسهل البحث وتحسين الترجمة إلى العيادة. بالنسبة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي ، يصعب استرداد الخلايا البشرية الأولية وتمثل مصدرا محدودا جدا لأن الخزعات غازية أو لا يمكن استرجاعها إلا بعد الوفاة في المرحلة النهائية من المرض. في السنوات ال 15 الماضية ، وتطوير تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا وسعت بسرعة القدرة على نموذج الأمراض العصبية العصبية والعصبية البشرية في المختبر.
تتضمن الطرق التقليدية لإعادة برمجة الخلايا إعادة برمجة الخلايا الليفية أو أنواع الخلايا الأخرى إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) قادرة على التفريق بين أنواع الخلايا من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث4. كان تاكاهاشي ويماناكا أول من أظهر أن إعادة التعبير عن أربعة عوامل لنسخ الخلايا الجذعية كافية لإعادة توجيه الخلايا الجسدية لتصبح iPSCs5. ويمكن بعد ذلك تمييز iPSCs إلى أنواع خلايا محددة. ومع ذلك ، فإن العيب في هذه العملية هو أنه من العمالة الكثيفة وتستغرق وقتا طويلا لتوليد وعزل استنساخ الخلايا الجذعية مستقرة. كما يتم الحفاظ على الطفرات الجسدية أو أبرانسات محددة من الخلية الأم في استنساخ الخلايا الجذعية ويمكن أن تؤثر على نتائجالدراسة 6. وبالإضافة إلى ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن عمليةإعادةبرمجة الخلايا الجذعية تمحو التغيرات اللاجينية القيمة التي يمكن أن تؤثر على آليات المرض الخلوي 4و7و8. في السنوات الأخيرة، ركز الباحثون على أساليب إعادة البرمجة المعدلة التي تسمح بتوليد أكثر مباشرة من أنواع الخلايا المختلفة مع تجاوز حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات9و10و11و12 (تمت مراجعتها في 13و14). كشفت الاختراقات الأولية في المختبر إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى خلايا القلب15، الخلايا العصبية16 وخلايا الكبد17 عن طريق التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ النسب محددة متعددة أو microRNAs18. وأعقب ذلك دراسات مباشرة إعادة برمجة الخلايا لنموذج الاضطرابات العصبية19,20. وكما ذكر أعلاه، فإن بروتوكولات إعادة البرمجة أو التحويل المباشرة هذه لها مزايا محتملة على بروتوكولات iPSC الكلاسيكية بما في ذلك السرعة واجتثاث خطوة العزلة اللاستنساخية. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة إلى أن هذه البروتوكولات تسمح بالحفاظ على كمية أكبر من المعلومات اللاجينية المتعلقة بعمر المريض ومن المرجح أن ينطبق الشيء نفسه على العلامات ذات الصلة بالمرض7،8.
حتى الآن، ركزت معظم البحوث في المختبر على الاضطرابات العصبية في المقام الأول على الخلايا العصبية. ومع ذلك ، فمن المعروف جيدا أن أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الفلكية ، microglia وoligodendrocytes تلعب دورا حاسما في أمراض الأمراض وتطور الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض باركنسون (PD) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، والتصلب المتعدد (MS) ، وأمراض عصبية أخرى مثل متلازمة ريت (RTT) ، واضطرابات النوم ، الإدمان والصرع واضطرابات التخزين الليسوسومية والاكتئاب والصداع النصفي والألم المرضي21،22،23،24،25،26. الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وحتى وقت قريب ، تم إهمالها على نطاق واسع من وجهة نظر مرضية7. ومن المعروف الآن أن لها دورا حاسما في دعم ما يقرب من جميع الوظائف الهوستاتيكية من الجهاز العصبي المركزي صحية. بالإضافة إلى ذلك ، من الواضح أن لها تأثيرا مرضيا مهما وقيمة جدا في فهم آلية المرض وتقييم الاستراتيجيات العلاجية19.
في الوصف الحالي ، نقوم بتفصيل بروتوكول للتحويل المباشر للخلايا الليفية للمريض البشري إلى خلايا سلف عصبية مستحثة (iNPCs) باستخدام ناقلات الفيروسات الرجعية التي تعبر عن عوامل إعادة برمجة Yamanaka (Klf4 ، Oct3 /4 ، Sox2 و c-Myc) والتعرض اللاحق لوسائل الإعلام العصبية. استخدمت الدراسات السابقة مجموعات مختلفة من العوامل النسخية لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا العصبية (تمت مراجعتها في 14)، ولكن العوامل المستخدمة في البروتوكول الموصوف متاحة على نطاق واسع إما كالبلازميدات في الإنتاج الداخلي للناقلات الفيروسية ، أو كما هي متاحة تجاريا جاهزة للذهاب مجموعات إعادة البرمجة الفيروسية. يمكن تمييز الخلايا العصبية الناتجة عن ذلك إلى خلايا عصبية مستحثة (iNs)27، oligodendrocytes (iOs)24 والخلايا الفلكية (iAS)19 لدراسة دورها في الأمراض العصبية. بروتوكولنا لا ينطوي على توليد تستغرق وقتا طويلا من iPSCs التي تستخدم معظم البروتوكولات المتاحة لاشتقاق الخلايا الفلكية البشرية28. ما يقرب من 98٪ إلى 100٪ من الشخصيات غير المبرمجة مباشرة يمكن أن تفرق إلى الخلايا الفلكية إيجابية GFAP29 بالمقارنة مع 2٪ فقط باستخدام طريقة التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا الفلكية30. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة نسخية مقارنة باستخدام طريقة إعادة البرمجة الموصوفة لدينا أن الشخصيات الطبيعية التي تمت برمجتها من الخلايا الليفية المانحة يمكن أن تحتفظ بميزات الشيخوخة على المستوى النسخي والوظيفي المشابه للعمر المطابق للخلايا الفلكية بعد الوفاة والخلايا الفلكية الأولية29. وبالتالي، فإن بروتوكول التحويل هذا هو أداة قوية للتحقيق في آليات المرض وتقييم النهج العلاجية الجديدة للاضطرابات العصبية والعصبية المرتبطة بالعمر.
هنا نصف البروتوكول المستخدمة لتوليد الشخصيات الوطنية والتمايز في اتفاقات الاستثمار الدولية ، والتي هي الأكثر ملاءمة على نطاق أوسع صغيرة الفحص الجزيئي المقايسات. يمكن القيام بآليات الأمراض واختبار الأدوية باستخدام iAs باستخدام منهجيات مختلفة مثل الثقافات المشتركة مع الخلايا العصبية أو التحليل الأيضي والكيميائي الحيوي. ميزة هذا النظام هو سرعة وسهولة صيانة هذه الخطوط الخلية بالمقارنة مع iPSCs. وعلاوة على ذلك، يمكن تجميد الشخصيات غير الوطنية في أجزاء صغيرة من أجل تمايز اتفاقات الاستثمار الدولية مما يسهل اختبار المخدرات في ظل ظروف ثابتة على مدى فترات طويلة من الزمن. وعموما، تصبح مقارنة أعداد العينات الأكبر ممكنة بهذه الطريقة التي تفتح الباب لتقييم الإمكانات العلاجية للمركبات في عدد أكبر وأكثر تمثيلا من المرضى.
باختصار ، التحويل المباشر هو طريقة سريعة وسهلة لتوليد خلايا السلف العصبية المستحثة من الخلايا الليفية الجلدية المريضة. هذا الأسلوب مفيد بسبب سرعته وكذلك العدد الكبير من الخلايا التي تم إنشاؤها التي يسهل الحفاظ عليها. وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن أساليب إعادة البرمجة المباشرة تزيل علامات أقل لا جينية مقارنة بتكنولوجيا إعادة برمجة iPSC الكلاسيكية، وبالتالي تتركبيئةالمرض أكثر سلامة 4و7و8. تمايز الشخصيات غير المعملية إلى الخلايا الفلكية مستقيم جدا إلى الأمام وقابل للاستنساخ للغاية حتى بين مختبرات مستقلة متعددة19،29،33. ويمكن تجميد الشخصيات غير المناقصة في أجزاء صغيرة وذوبانها مباشرة لأغراض التمايز، مما يساعد على تقليل التباين بين التجارب حيث يمكن الاحتفاظ بأرقام المرور متشابهة. تلعب الخلايا الفلكية دورا حاسما في تطور المرض في العديد من الأمراض العصبية ، وبالتالي فهي نوع من الخلايا المثيرة للاهتمام للعمل معها. يمكن استخدام الخلايا الفلكية للدراسات الميكانيكية أو الدراسات الأيضية أو فحوصات اختبار المخدرات وعادة ما تزرع كخلايا أحادية. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا الفلكية في نظم الثقافة المشتركة مع الماوس أو الخلايا العصبية البشرية لتقييم تأثير الخلايا الفلكية على بقاء الخلايا العصبية ومورفولوجيا، وكلاهما قراءات جيدة لاختبار المخدرات34.
من أجل استخدام هذا البروتوكول بنجاح، يجب أن يتم الأخذ بعين الاعتبار بعض النقاط والقيود المحتملة. الخلايا الليفية الجلد البشري على سبيل المثال تختلف اختلافا كبيرا في معدل انقسام الخلايا، فضلا عن الاستجابة لنواقل الفيروسية. وبما أن هذه ليست خطوط الخلايا الموحدة، فهي متغيرة مثل البشرية نفسها، كل سطر مختلف. أما بالنسبة للعديد من أساليب إعادة البرمجة، فمن الأسهل إعادة برمجة الخلايا الليفية التي لديها معدل انقسام الخلايا المعتدلة إلى السريعة مقابل الخلايا التي بالكاد تكرر. يمكن أن يتأثر معدل النسخ المتماثل بجودة خزعة الجلد ومعالجة نفسه ، من خلال عدد مرور الخلايا الليفية وكذلك المناولة. عند العمل مع الخلايا الليفية الجلدية الأولية، من المهم عدم السماح للخلايا الحصول على كثيفة جدا لتجنب تحريض الشيخوخة. إذا كانت الخلايا الليفية لا تنمو بشكل جيد ، فمن الأفضل تجربة مخزون جديد أو ممر أقل ، على الرغم من أنه في بعض الحالات ، يمكن أن يلعب المرض نفسه دورا أيضا. يمكن تحسين انقسام الخلايا في بعض الأحيان باستخدام 15٪ أو 20٪ FBS في وسائط الخلايا الليفية مقارنة ب 10٪ القياسية.
نوعية إعادة برمجة ناقلات الفيروسية ذات أهمية كبيرة للنجاح. في أيدينا، كانت ناقلات الفيروسات الرجعية أكثر كفاءة بالمقارنة مع ناقلات العدسية أو غيرها من الفيروسات غير المتكاملة؛ ومع ذلك ، يمكن أن يعتمد هذا على جودة النواقل الفيروسية والنقاء. مجموعات ناقلات الفيروسات الرجعية التجارية عادة تحديد تركيز ناقلات الفيروسية وغالبا ما أيضا تعدد العدوى لخط الخلية معينة. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الخلايا الليفية الأولية تختلف عن خط الخلية المستخدمة من قبل الشركات لتحديد امتصاص ناقلات الفيروسية. وعلاوة على ذلك، حتى عند طلب نفس المجموعة التجارية، والاختلاف بين دفعات أمر شائع. وعلاوة على ذلك، فإن امتصاص ناقلات الفيروسية يختلف أيضا بين خطوط الخلايا الليفية. يمكن أن تكون بعض الخطوط أكثر حساسية وبالتالي يمكن أن تموت الخلايا المنقولة ، في حين أن خطوط الخلايا الأخرى قد تكون أكثر مقاومة لامتصاص الفيروس. وبالتالي، يمكن تحديد كفاءة النقل لخط خلية معينة تكون مهمة خاصة إذا كان خط الخلية ينمو ببطء أو فشلت محاولات التحويل السابقة. في أيدينا ، فإن أفضل طريقة لتقييم مقدار ناقل فيروسي معين مطلوب للتحويل هي إجراء تلطيخ مناعي مع العديد من التخفيفات من الناقل الفيروسي. ويمكن بعد ذلك حساب عدد الخلايا التي تعبر عن المتحول لكل متجه، بهدف تحقيق كفاءة في النقل بنسبة 70 في المائة أو أكثر. في تجربتنا، يمكن استخدام MOIs مماثلة لمعظم خطوط الخلية ولكن يمكن تعديل وزارة الداخلية إذا لزم الأمر.
أثناء عملية التحويل، من الضروري عدم تقسيم الخلايا مبكرا جدا. يعتمد الوقت حتى تصبح الخلايا جاهزة للانقسام على عوامل متعددة بما في ذلك خط الخلية الأساسي وخصائصه وجودة الناقل الفيروسي المستخدم وجودة الوسائط. الأهم من ذلك ، فإن معدل نجاح التحويل أعلى بكثير عندما يتم الاحتفاظ بالخلايا بكثافة عالية. حتى لو بدأت الخلايا في تغيير مورفولوجيا، فمن الأفضل ترك الخلايا في أول أطول بكثير من تقسيمها قبل الأوان. إذا حدث الانقسام في وقت مبكر جدا التحويل يمكن أن تتوقف في تقدمها وتؤدي الخلايا للتمييز مرة أخرى إلى شكل مثل الخلايا الليفية والسلوك. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تمييعها في وقت مبكر جدا إلى أجسام خلايا أكثر استطالة مقارنة بأجسام الخلايا الصغيرة والمدمجة للشخصيات التي لوحظت سابقا. وبالتالي، ينبغي أن تكون الانقسامات الأولى محافظة دائما؛ وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة من الانقسامات، وينبغي أن تكون الانقسامات الأولى في حالة فمن الأفضل للحفاظ على الخلايا كثيفة جدا مع انقسام 1:1 أو 1:2 مقارنة مع تمييع لهم أكثر من اللازم. ومن المتوقع حدوث بعض وفيات الخلايا بعد الانقسام الأولي. من الجدير بالذكر أن الخلايا تبدو دائما أسوأ (تملق) في اليوم الأول بعد تقسيم، وهو أمر طبيعي. وينبغي أن يكون أفضل الأحكام على شكل الخلية 2-3 أيام في وقت لاحق. والأهم من ذلك أن نوعية عوامل النمو ومكونات وسائط الإعلام أمر بالغ الأهمية أيضا. من المهم إعداد كميات صغيرة من الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو بحيث يتم استخدام الوسائط المعدة بالكامل فقط لمدة 5-7 أيام كحد أقصى. لا تبقي الوسائط في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. استخدمها بسرعة ثم قم بتبريدها بمجرد إجراء تغيير الوسائط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يساعد الحفاظ على مستوى صوت الوسائط منخفضا عند 1 مل بدلا من 2 مل خاصة بالنسبة لخطوط الخلايا الأكثر مقاومة للتحويل. إذا كانت الخلايا تستهلك وسائل الإعلام بسرعة، والتي يمكن ملاحظتها عن طريق تغيير في شكل لون الوسائط الأحمر إلى الأصفر (معدل الحموضة)، وضبط حجم وسائل الإعلام إلى ما يصل إلى 2 مل. 10 – ويعتبر الاستهلاك السريع لوسائط الإعلام علامة إيجابية، وكثيرا ما يلاحظ في مراحل لاحقة من التحويل إلى جانب زيادة الانتشار.
كما أن الشخصيات غير المكتتة بالشخصيات حساسة جدا لوجود الأكوتاسي في وسائط الإعلام، ومن المهم جدا أن تبقي فترة حضانة الأكوتاسي قصيرة. نوصي بفترة حضانة مدتها 2-4 دقائق ، وفحص الخلايا بشكل متكرر تحت المجهر لمعرفة متى انفصلت. من الضروري طرد الخلايا بعد تقسيمها لإزالة مزيج الإنزيم من الوسائط. من المهم أيضا أن نأخذ رقم المرور في الاعتبار حيث يمكن أن تتغير خطوط الخلية عند الاستزراع الممتد مما يؤدي إلى تغيير ملامح التعبير. وبالتالي، من المهم تجميد العديد من مخزونات الخلايا في الممرات المبكرة. يجب تجميد الخلايا في 10٪ DMSO و 90٪ وسائل الإعلام المجلس الوطني للصحافه وتخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل. بسبب عدم وجود مصل في هذه الوسائط من الأهمية بمكان ضمان تجميد بطيء باستخدام غرف التجميد وتجميد مرة واحدة بين عشية وضحاها، ونقل فورا إلى النيتروجين السائل. في حين لا يتم إجراء اختيار كلونال في هذا البروتوكول، فمن الممكن أن الاستزراع الموسع والتمريرة يؤدي إلى الانتقاء الطبيعي للسكان الخلية الأولية مع النمو مواتية ومعدل البقاء على قيد الحياة. لذلك ، من المهم أن نأخذ رقم المرور والمناولة في الاعتبار عند إجراء التجارب. نحن نفضل استخدام مقاطع أقل للتجارب ، إذا كان ذلك ممكنا ، لا نتجاوز تمرير خطوط الخلية لأكثر من 20 مرة. وبما أن المركبات غير الوطنية تنمو بسرعة، يمكن تجميد أعداد كبيرة من المخزونات في ممرات أدنى للتجارب. خطوط الخلايا ذات معدلات النمو المرتفعة بشكل خاص هي أكثر عرضة لتحمض وسائل الإعلام. وهكذا، ومع نمو خطوط الخلايا بسرعة مختلفة، قد تحتاج كمية الوسائط إلى تعديل استنادا إلى الانتشار. إذا تركت الخلايا باستمرار في وسائل الإعلام المحمضة للغاية، فإنه يمكن أن تؤثر على صحة كل من السيطرة وخطوط خلايا المرض. وهذا يؤدي حتى الخلايا الفلكية صحية لتصبح رد الفعل، مما يؤثر على استخدامها في مزيد من التمايز والتجارب.
بالنسبة لتمايز الخلايا الفلكية ، من المهم الحفاظ على الخلايا في كثافة منخفضة حيث أن الكثافة العالية ستمنع الخلايا من التفريق وستواصل الانتشار بمعدلات أعلى. وبالتالي، يجب تعديل كثافة البذر لكل خط خلية يعتمد على معدل انتشارها. نوصي بتجربة كثافات البذر المختلفة وتنفيذ البقع / RT-PCR مع علامات الخلايا الفلكية لضمان التمايز المناسب. يمكن تقييم جودة IAs جنبا إلى جنب مع الضوابط الصحية باستخدام المقايسات الثقافة المشتركة مع الخلايا العصبية. شريطة أن لا يؤدي مرض الأمراض إلى النمط الظاهري التفاعلي ، يجب أن تظل الخلايا العصبية قابلة للحياة في اتصال مع iAs لعدة أيام. يمكن أن يختلف مورفولوجيا الخلايا الفلكية بشكل كبير بين خطوط الخلايا الفردية ويمكن أن يتأثر بالنمط الظاهري للمرض أيضا. وعلاوة على ذلك، في الأمراض التي تتأثر فيها الخلايا الفلكية بشكل كبير، فإنها قد تظهر النمط الظاهري التفاعلي مع تمديدات كبيرة ممدود.
The authors have nothing to disclose.
نشكر جميع المرضى والمتطوعين الأصحاء على التبرع بعينات حرجة للدراسات البحثية. وعلاوة على ذلك، نشكر روشيل رودريغو على المساعدة التقنية المستمرة من الخبراء في زراعة الأنسجة ولورا فيرايولو لتأكيدها بشكل مستقل هذه التقنية في مختبرها كمتعاون. تلقى هذا العمل تمويلا من المعاهد الوطنية الأمريكية للمنح الصحية R01 NS644912-4 وRC2 NS69476-01 (إلى A.L.S.) ومركز باكارد لمنحة أبحاث ALS P2ALS ومؤسسة ربط المساعدة. كما تلقت .M تمويلا من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم، فضلا عن جائزة تطوير المحققين الشباب من رابطة ضمور العضلات، وصندوق بحوث متلازمة ريت، وأسر مؤسسات SCN2A.
100mm x 2mm Style dish, Cell culture treated, Nonpyrogenic | Corning | 430167 | Tissue culture |
15 ml conical screw cap centrifuge tubes, copolymer polypropylene | USA Scientific | 1475-1611 | Used for lifting and centrifuge cells |
50mL Conical Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1500-1811 | Media preparation |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Antibiotic with antifungal activity for media preparation |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen | 17504044 | For NPC and base media |
Cryogenic vials 1.2ML | Corning | CLS430658-500EA | For freezing cell stocks |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569010 | For fibroblast and Astrocyte media |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565042 | For NPC and base media |
DMSO | Sigma | D2438-50ML | For freezing cell stocks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190136 | Referred in protocol as PBS. For fibronectin dilution and cell wash |
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit | ALSTEM | RF101 | Retrovirus containing the Yamanaka factors. Virus can also be made in-house. |
Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000-036 | Referred in protocol as FBS . For Fibroblast and Astrocyte media |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher | 14-955-461 | Filter media (50mL) |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149-10KU | Referred in protocol as Heparin. Used in conversion media. Powder diluted in ultrapure water. Final stock concentration of 5000X |
Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore Sigma | FC010-10MG | Referred in protocol as Fibronectin, used in 1:200 dilution for coating. |
Isopropanol (technical grade) | Fisher Scientific | S25372A | For freezing cell stocks |
Mr. Frosty | Thermo Fisher | 5100-0001 | For freezing cell stocks |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | For Astrocyte, NPC and base media |
Recombinant Human EGF | Preprotech | AF-100-15 | Referred in protocol as EGF, used in conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
Recombinant Human FGF-basic | Preprotech | 100-18B | Referred in protocol as FGF, used in NPC and conversion media. Powder diluted in PBS, final concentration of 1mg/mL, stored in small frozen aliquots |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Referred in protocol as Accutase. Used for lifting during the conversion process and NPCs. |
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System | Millipore Sigma | S2GPU05RE | Media filtration |
Tissue culture plate, 6 well, Flat bottom with Low evaporation lid | Fisher | 08-772-1B | Tissue culture |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Invitrogen | 25300062 | Lifting of Fibroblasts and Astrocytes |
Whatman Puradisc 25 syringe filters, 0.2 μm, PES sterile | Millipore Sigma | 80-2502 | Filter media (50mL) |