Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Summary

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Abstract

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de células eucariotas capaces de respirar aeróbicos. Contienen genoma circular y aparatos de expresión génica. Un genoma mitocondrial de la levadura de panadero codifica ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima oxidorreductasa ubiquinol-citocromo c, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p. El propósito del método descrito aquí es etiquetar específicamente estas proteínas con metionina ³⁵S, separarlas por electroforesis y visualizar las señales como bandas discretas en la pantalla. El procedimiento implica varios pasos. En primer lugar, las células de levadura se cultivan en un medio que contiene galactosa hasta que llegan a la etapa de crecimiento logarítmico tardío. A continuación, el tratamiento con cicloheximida bloquea la traducción citoplasmática y permite la incorporación de metionina ³⁵S solo en productos de traducción mitocondrial. Luego, todas las proteínas se extraen de las células de levadura y se separan por electroforesis de gel de poliacrilamida. Finalmente, el gel se seca e incuba con la pantalla de fósforo de almacenamiento. La pantalla se escanea en un fosforimagen que revela las bandas. El método se puede aplicar para comparar la tasa de biosíntesis de un solo polipéptido en las mitocondrias de una cepa de levadura mutante en comparación con el tipo salvaje, que es útil para estudiar defectos de expresión génica mitocondrial. Este protocolo proporciona información valiosa sobre la tasa de traducción de todos los mRNAs mitocondriales de levadura. Sin embargo, requiere varios controles y experimentos adicionales para sacar conclusiones apropiadas.

Introduction

Las mitocondrias son los orgánulos profundamente involucrados en el metabolismo de una célula eucariota. Su cadena de transferencia de electrones suministra a la célula ATP, la principal moneda energética utilizada en múltiples vías bioquímicas. Además, están involucrados en apoptosis, síntesis de ácidos grasos y hemo, y otros procesos. La disfunción de las mitocondrias es una fuente bien conocida de la enfermedad humana^1. Puede ser el resultado de mutaciones en genes nucleares o mitocondriales que codifican componentes estructurales o reglamentarios de los orgánulos^2. La levadura saccharomyces cerevisiae de Baker es un excelente organismo modelo para estudiar la expresión génica mitocondrial debido a varias razones. En primer lugar, su genoma está completamente secuenciado^3,bien anotado, y una gran suma de datos ya está disponible en la literatura gracias a la larga historia de investigaciones llevadas a cabo con este organismo. En segundo lugar, las manipulaciones con su genoma nuclear son relativamente rápidas y fáciles debido a su rápida tasa de crecimiento y su sistema de recombinación homóloga altamente eficiente. En tercer lugar, la levadura de panadero S. cerevisiae es uno de los pocos organismos para los que se desarrollan las manipulaciones con genomas mitocondriales. Por último, la levadura de panadero es un organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite el aislamiento y estudio de mutantes respiratorios defectuosos, ya que pueden crecer en medios que contienen fuentes de carbono fermentables.

Describimos el método para estudiar la expresión génica mitocondrial de la levadura de panadero S. cerevisiae en el nivel traslacional^4. Su principio principal proviene de varias observaciones. En primer lugar, el genoma mitocondrial de levadura codifica sólo ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductasa, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p^5. Este número es pequeño, y todos ellos pueden ser separados por electroforesis en un solo gel en las condiciones adecuadas. En segundo lugar, los ribosomas mitocondriales pertenecen a la clase procariota en lugar de eucariota^6,y por lo tanto, la sensibilidad a los antibióticos es diferente para los ribosomas citoplasmáticos y mitocondriales de levadura. Permite la inhibición de la traducción citoplasmática con cicloheximida, proporcionando las condiciones cuando el aminoácido etiquetado⁽³⁵S-metionina) se incorpora sólo en productos de traducción mitocondrial. Como resultado, el experimento proporciona información sobre la tasa de incorporación de aminoácidos en proteínas mitocondriales sintetizadas de novo, reflejando la eficiencia general de la traducción mitocondrial para cada uno de los ocho productos

Protocol

1. Preparación de la cultura de levadura Levadura de rayas de los cultivos de caldo congelado en platos frescos con el medio adecuado. Ponga las placas en una incubadora de cultivo a 30 °C durante 24-48 h.NOTA: Deje que los mutantes sensibles a la temperatura crezcan a la temperatura permisiva. Inocular cultivos de levadura en 2 ml de media YPGal (2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% galactosa) de la veta fresca en tubos de 15 ml e incubarlos durante la noche agitando a 200 rpm a 30 °C….

Representative Results

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, asignamos productos de traducción mitocondrial de dos cepas S. cerevisiae: el tipo salvaje (WT) y una eliminación de rodamientos mutantes del gen AIM23 (AIM23Δ), que codifica el factor de iniciación de traducción mitocondrial 3 (Cuadro 1)8. Los productos de traducción mitocondrial fueron etiquetados radiactivamente y separados en SDS-PAAG9. Las muestras se recogieron cada 2,5 minutos antes de …

Discussion

Las investigaciones sobre la expresión génica ocupan una parte central en las ciencias de la vida modernas. Se han desarrollado numerosos métodos que proporcionan información sobre este complejo proceso. Aquí, describimos el método que permite acceder a la biosíntesis proteica en la levadura de panadero S. cerevisiae mitocondrias. Por lo general, se aplica para comparar las eficiencias de traducción de los ARNM en las mitocondrias de la cepa de levadura mutante frente al tipo salvaje para acceder a las c…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625