Усовершенствованная очистка тканей на основе CLARITY для трехмерной организации фибробластов в здоровых и поврежденных сердцах мышей
Summary
Усовершенствованный метод очистки тканей был разработан и применен к сердцу взрослой мыши. Этот метод был разработан для очистки плотной, аутофлуоресцентной сердечной ткани, сохраняя при этом меченую флуоресценцию фибробластов, приписываемую стратегии генетического репортера.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее распространенной причиной смертности во всем мире и часто отмечаются повышенным сердечным фиброзом, который может привести к увеличению жесткости желудочков с измененной сердечной функцией. Это увеличение фиброза сердечных желудочков связано с активацией резидентных фибробластов, хотя то, как эти клетки работают в 3-мерном (3-D) сердце, на исходном уровне или после активации, не совсем понятно. Чтобы изучить, как фибробласты способствуют сердечным заболеваниям и их динамике в 3-D сердце, был разработан усовершенствованный метод очистки и визуализации тканей на основе CLARITY, который показывает флуоресцентно меченые сердечные фибробласты во всем сердце мыши. Тканевые резидентные фибробласты были генетически мечеными с использованием флуоресцентных мышей Rosa26-loxP-eGFP, скрещенным с сердечным фибробластом, экспрессирующим Tcf21-MerCreMer. Этот метод был использован для наблюдения динамики локализации фибробластов по всему левому желудочку взрослого человека у здоровых мышей и у фиброзных мышиных моделей сердечных заболеваний. Интересно, что в одной модели травмы уникальные паттерны сердечных фибробластов наблюдались в поврежденном сердце мыши, которые следовали за полосами обернутых волокон в сократительном направлении. В моделях ишемического повреждения произошла гибель фибробластов с последующей репопуляцией из пограничной зоны инфаркта. В совокупности этот усовершенствованный метод осветления сердечной ткани и оцифрованная система визуализации позволяют проводить 3-D визуализацию сердечных фибробластов в сердце без ограничений недостаточности проникновения антител или предыдущих проблем, связанных с потерей флуоресценции из-за обработки тканей.
Introduction
Хотя кардиомиоциты составляют наибольшую объемную фракцию в сердце, сердечные фибробласты более многочисленны и критически участвуют в регулировании исходных структурных и репаративных особенностей этого органа. Сердечные фибробласты очень подвижны, механически чувствительны и фенотипически ранжируются в зависимости от степени их активации. Сердечные фибробласты необходимы для поддержания нормального уровня внеклеточного матрикса (ECM), и слишком мало или слишком много производства ECM этими клетками может привести к заболеванию1,2,3. Учитывая их важность в заболевании, сердечные фибробласты становятся все более важной темой исследований для выявления новых стратегий лечения, особенно в попытке ограничить чрезмерный фиброз4,5,6,7. При повреждении фибробласты активируются и дифференцируются в более синтетический тип клеток, известный как миофибробласт, который может быть пролиферативным и секретировать обильный ECM, а также иметь сократительную активность, которая помогает ремоделировать желудочки.
В то время как сердечные фибробласты были широко оценены на их свойства в 2-D культурах6,8,9,10,гораздо меньше понимаются их свойства и динамика в 3-D живом сердце, либо на исходном уровне, либо при стимуляции заболевания. Здесь был описан усовершенствованный метод очистки тканей сердца взрослой мыши при сохранении флуоресценции фибробластов, помеченных генетической репортерной системой Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. В сердце Tcf21 является относительно специфическим маркером покоя фибробластов4. После того, как тамоксифен дается для активации индуцируемого белка MerCreMer, по существу все покояющиеся фибробласты будут постоянно экспрессировать усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) из локуса Rosa26, что позволяет отслеживать их in vivo.
Существует множество хорошо заясневших протоколов очистки тканей, некоторые из которых были применены к сердцу11,12,13,14,15,16,17. Однако было обнаружено, что многие из реагентов, используемых в различных протоколах очистки тканей, гасят эндогенные флуоресцентные сигналы18. Кроме того, сердце взрослого человека трудно очистить из-за обильных белков, содержащих гемовую группу, которые генерируют автофлуоресценцию19. Поэтому целью данного протокола было сохранение флуоресценции маркера фибробластов с одновременным ингибированием гемовой аутофлуоресценции в поврежденном сердце взрослого человека дляоптимальной 3-D визуализации in vivo12,13,14,16,17,20.
Предыдущие исследования, в которых предпринимались попытки изучить сердечный фибробласт in vivo, использовали перфузированные антитела для маркировки этих клеток, хотя такие исследования были ограничены проникновением антител и структурой сердечного сосуда14,16,17,20. Хотя Salamon et al. показали очистку тканей с поддержанием местной флуоресценции нейронов в сердце новорожденного, а Nehrhoff et al. показали поддержание флуоресценции, отмечающей миелоидные клетки, поддержание эндогенной флуоресценции через всю стенку желудочка еще не было продемонстрировано, включая визуализацию взрослых сердечных фибробластов на исходном уровне или после травмы13,20. Этот протокол очистки тканей уточняет смесь предыдущих протоколов, основанных на методе CLARITY (прозрачный липидообменный акриламид-гибридизированный жесткий imaging/immunostaining/in situ-гибридизация-совместимый тканевой гидрогель) и PEGASOS (полиэтиленгликоль(ПЭГ)-ассоциированная система растворителей). Этот усовершенствованный протокол позволил провести более надежное исследование сердечных фибробластов в сердце мыши на исходном уровне и того, как они реагируют на различные типы травм. Протокол прост и воспроизводим и поможет охарактеризовать поведение сердечных фибробластов in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен усовершенствованный метод очистки тканей, который позволяет визуализировать сердечные фибробласты in vivo, как на исходном уровне, так и после травмы, чтобы охарактеризовать и лучше понять фибробласты в сердце мыши. Этот расширенный протокол устраняет ограниче?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить CCHMC Confocal Imaging Core за их помощь и руководство в разработке этой модели, а также Мэтта Бати из Clinical Engineering за дизайн всех 3D-печатных деталей. Деметрия Фишер была поддержана грантом на обучение от Национального института здравоохранения (NHLBI, T32 HL125204), а Джеффри Д. Молкентин был поддержан Медицинским институтом Говарда Хьюза.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
References
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
