Summary

Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen

Published: April 18, 2021
doi:

Summary

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het scheiden van folliculaire cellen en oöcyten in eierstokfollikels van zebravissen, wat het onderzoek naar de ontwikkeling van eierstokvissen bij zebravissen zal vergemakkelijken.

Abstract

Zebravissen zijn een ideaal model geworden om de eierstokontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. De follikel is de basiseenheid van de eierstok, die bestaat uit oöcyten en omliggende folliculaire cellen. Het is van vitaal belang om zowel folliculaire cellen als oöcyten te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals voor primaire cultuur van folliculaire cellen, analyse van genexpressie, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie, enz. De conventionele methode gebruikt tangen om beide compartimenten te scheiden, wat arbeidsintensief, tijdrovend en hoge schade aan de oöcyt heeft. Hier hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten te scheiden met behulp van een getrokken glazen capillair. Onder een stereomicroscoop kunnen oöcyten en folliculaire cellen gemakkelijk worden gescheiden door pipetten in een getrokken fijn glazen capillair (de diameter is afhankelijk van de follikeldiameter). In vergelijking met de conventionele methode heeft deze nieuwe methode een hoog rendement bij het scheiden van zowel oöcyten als folliculaire cellen en heeft het een lage schade aan de oöcyten. Wat nog belangrijker is, deze methode kan worden toegepast op follikels in een vroeg stadium, ook in het stadium vóór vitellogenese. Deze eenvoudige methode kan dus worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten van zebravissen te scheiden.

Introduction

Zebravis is een belangrijk modelorganisme voor de studie van gewervelde ontwikkeling en fysiologie. De zebravis kan dienen als een goed model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van eierstokontwikkeling1,2,3. Veel kenmerken van de ontwikkeling van de eierstok zijn veel behouden tijdens de evolutie van vis naar zoogdieren1,2. Net als de andere gewervelde dieren hebben zebravisvolwassenen asynchrone eierstokken, die ovariële follikels van alle ontwikkelingsstadia bevatten4. De follikel is het fundamentele reproductieve element van de eierstok. De follikel bestaat uit de oöcyt die wordt omgeven door een of meerdere lagen somatische cellen die folliculaire cellen worden genoemd. De ontwikkeling van follikels hangt af van de bidirectionele communicatie tussen oöcyten en folliculaire cellen5. Het is van vitaal belang om folliculaire cellen en oöcytcellen van ovariële follikels te scheiden voor verschillende onderzoeksdoeleinden, zoals folliculaire cel primaire cultuur, genexpressieanalyse, oöcytrijping en in-vitrofertilisatie.

Traditionele scheidingsmethoden omvatten mechanische scheiding door tang en enzymatische vergisting6,7,8,9,10. De mechanische scheiding door een tang is echter tijdrovend en arbeidsintensief. Het zal ook de hoge schade aan de oöcyt veroorzaken tijdens de scheiding. Hoewel de enzymverteringsmethode eenvoudig te bedienen is en een korte tijd vereist, moeten de behandelingstijd en enzymconcentratie worden gevalideerd en zijn de integriteit en overlevingskans van de geïsoleerde oöcyten niet ideaal. Daarom hebben we een eenvoudige methode opgezet om beide compartimenten in verschillende ontwikkelingsstadia te scheiden met behulp van getrokken glazen capillaire buizen.

Protocol

Alle procedures die worden uitgevoerd in visexperimenten zijn in overeenstemming met de voorschriften van de Animal Experimentation Ethics Committee van Northwest Normal University. 1. Voorbereidingen Dieren Gebruik volwassen vrouwelijke zebravissen met een lichaamslengte van 4-6 cm.OPMERKING: We gebruikten zebravissen van een lokale markt. Houd de zebravis in een circulerend watersysteem met een licht van 14 uur en een donkere cyclus van 10 uur bij ongeveer 28…

Representative Results

Deze methode kan worden gebruikt om folliculaire cellen en oöcyten te scheiden in verschillende stadia van de ontwikkeling van de eierstokfollikel bij zebravissen. Figuur 1 toont de scheiding van zebravisoocyten en folliculaire cellen van ovariële follikels met behulp van een capillaire glazen buis (figuur 1). Om te onderzoeken of de folliculaire cellen gescheiden waren van intacte follikels, werden de intacte follikels en gescheiden oöcyten van verschillende…

Discussion

We beschrijven hier een nieuwe methode voor de eenvoudige en snelle scheiding van folliculaire cellen en oöcyten van eierstokfollikels van zebravissen. Deze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van de conventionele methode. Primair is het sterk toegenomen scheidingsgemak met hoge efficiëntie en effectiviteit, omdat slechts één enkele en externe manipulatie vereist is. Dit punt verhoogt de toepasbaarheid voor onderzoekers die niet goed zijn in microscopische anatomie. Volgens onze ervaring kan men follic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 en 31560334], visiting scholar project ondersteund door China Scholarship Council en het fonds van State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology [2020FB05].

Materials

17α,20β-DHP Cayman 16146-5 (5 mg)
24-well plate Corning 3524
Ampoule cutter AS ONE 5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4 Kaixin Chemical 500 g
Brine shrimp Hongjie 250 g
CaCl2 Beichen Fangzheng 500 g
Culture dish Biosharp BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI Solarbio S2110 (25mL)
Dissecting Microscope ZEISS Stemi 305
Dissection forcep VETUS HRC30
Dissection scissor Kefu 160 mm 
Fluorescence Stereomicroscope  Leica M205C
Glass capillary IWAKI IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342 Solarbio C0031 (1 mg)
KCl Beichen Fangzheng 500 g
KH2PO4 Kaixin Chemical 500 g
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O Beichen Fangzheng 500 g
Micropipette tips Axygen MCT-150-C
NaCl Beichen Fangzheng 500 g
NaHCO3 Beichen Fangzheng 500 g
Penicilia-streptomycia Gibco #15140122 (100 mL)
Stereomicroscope ZEISS Discover.v20

References

  1. Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
  2. Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
  3. Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
  4. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
  5. Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
  6. Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
  7. Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
  8. Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
  9. Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
  10. Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
  11. Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
  12. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
  13. Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
  14. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
  15. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
  16. Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).

Play Video

Cite This Article
Wang, W., Kang, T., Bai, L., Hu, W., Obata, Y., Li, J. Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62027, doi:10.3791/62027 (2021).

View Video