فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي
Summary
هنا، نقدم طريقة بسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض حمار وحشي، والتي سوف تسهل التحقيقات في تطور المبيض في حمار وحشي.
Abstract
أصبح حمار وحشي نموذجا مثاليا لدراسة تطور المبيض من الفقاريات. الجريبات هي الوحدة الأساسية للمبيض ، والتي تتكون من البويضات والخلايا الجريبية المحيطة بها. من الضروري فصل كل من الخلايا الجريبية والبويضات لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية ، وتحليل التعبير الجيني ، ونضوج البويضات والإخصاب في المختبر ، إلخ. تستخدم الطريقة التقليدية ملقط لفصل كلا المقصورتين ، وهو أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا ويلحق ضررا كبيرا بالبويضات. هنا، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية سحبت. تحت منظار مجسم ، يمكن فصل البويضات والخلايا الجريبية بسهولة عن طريق الأنابيب في الشعيرات الدموية الزجاجية الدقيقة التي يتم سحبها (يعتمد القطر على قطر الجريب). بالمقارنة مع الطريقة التقليدية، هذه الطريقة الجديدة لديها كفاءة عالية في فصل كل من البويضات والخلايا الجريبية ولها ضرر منخفض للبويضات. والأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة على بصيلات المرحلة المبكرة بما في ذلك في مرحلة ما قبل تكوين الفيتيلوجينيسيس. وهكذا، يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لفصل الخلايا الجريبية والبويضات من حمار وحشي.
Introduction
حمار وحشي هو كائن نموذجي رئيسي لدراسة تطوير الفقاريات وعلم وظائف الأعضاء. الحمار الوحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج جيد لدراسة الآليات الجزيئية لتطوير المبيض1،2،3. يتم الحفاظ على العديد من ملامح تطور المبيض كثيرا خلال التطور من الأسماك إلى الثدييات1،2. على غرار الفقاريات الأخرى ، فإن البالغين حمار وحشي لديهم مبايض غير متزامنة ، تحتوي على بصيلات المبيض لجميع مراحل النمو4. الجريب هو العنصر التناسلي الأساسي للمبيض. تتكون الجريبات من البويضات التي تحيط بها طبقة أو عدة طبقات من الخلايا الجسدية تسمى الخلايا الجريبية. يعتمد تطور الجريبات على الاتصال ثنائي الاتجاه بين البويضات والخلايا الجريبية5. من الضروري فصل الخلايا الجريبية والبويضات عن بصيلات المبيض لأغراض بحثية مختلفة مثل الثقافة الأولية للخلايا الجريبية، وتحليل التعبير الجيني، ونضوج البويضات، والإخصاب في المختبر.
طرق الفصل التقليدية تشمل الفصل الميكانيكي بواسطة ملقط والهضم الأنزيمي6،7،8،9،10. ومع ذلك ، فإن الفصل الميكانيكي عن طريق ملقط يستغرق وقتا طويلا وشاقة. وسوف يسبب أيضا ضررا كبيرا على البويضات أثناء الانفصال. على الرغم من أن طريقة هضم الإنزيم بسيطة للعمل وتتطلب وقتا قصيرا ، إلا أنه يجب التحقق من صحة وقت العلاج وتركيز الإنزيم ، ومعدل سلامة البويضات المعزولة وبقائها ليست مثالية. لذلك، أنشأنا طريقة بسيطة لفصل كلا المقصورتين في مراحل النمو المختلفة باستخدام أنابيب الشعيرات الدموية الزجاجية المنسحبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف هنا طريقة جديدة للفصل البسيط والسريع للخلايا الجريبية والبويضات من بصيلات المبيض حمار وحشي. هذا الأسلوب له العديد من المزايا على الطريقة التقليدية. ومن بين هذه العوامل الرئيسية زيادة سهولة الفصل بدرجة كبيرة مع كفاءة وفعالية عالية، حيث لا يلزم سوى معالجة واحدة وخارجية. هذه النقطة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل البحثي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [32060170 و 31601205 و 31560334] ، وهو مشروع باحث زائر يدعمه مجلس المنح الدراسية الصيني وصندوق مختبر الدولة الرئيسي لإيكولوجيا المياه العذبة والتكنولوجيا الحيوية [2020FB05].
Materials
| 17α,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Ampoule cutter | AS ONE | 5-124-22 1 bag (100 pieces) | |
| Anhydrous Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Brine shrimp | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Culture dish | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Dissecting Microscope | ZEISS | Stemi 305 | |
| Dissection forcep | VETUS | HRC30 | |
| Dissection scissor | Kefu | 160 mm | |
| Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M205C | |
| Glass capillary | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pcs/PACK) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 41300-039 (10×1L) | |
| MgSO4•7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Micropipette tips | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscope | ZEISS | Discover.v20 |
References
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
- Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
- Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
- Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
- Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
- Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
- Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
- Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213 (2017).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492 (2016).
- Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555 (2016).
- Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).
