Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Summary

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.

Abstract

Zebrafische sind zu einem idealen Modell geworden, um die Eierstockentwicklung von Wirbeltieren zu untersuchen. Der Follikel ist die Grundeinheit des Eierstocks, die aus Eizellen und umgebenden Follikelzellen besteht. Es ist wichtig, sowohl Follikelzellen als auch Eizellen für verschiedene Forschungszwecke zu trennen, wie z. B. für die Primärkultur von Follikelzellen, die Analyse der Genexpression, die Oozytenreifung und die In-vitro-Fertilisation usw. Die herkömmliche Methode verwendet Zangen, um beide Fächer zu trennen, was mühsam, zeitaufwändig ist und hohe Schäden an der Eizelle hat. Hier haben wir eine einfache Methode etabliert, um beide Fächer mit einer gezogenen Glaskapillare zu trennen. Unter einem Stereomikroskop können Eizellen und Follikelzellen leicht durch Pipettieren in einer gezogenen feinen Glaskapillare getrennt werden (der Durchmesser hängt vom Follikeldurchmesser ab). Im Vergleich zur herkömmlichen Methode hat diese neue Methode eine hohe Effizienz bei der Trennung von Eizellen und Follikelzellen und hat geringe Schäden an den Eizellen. Noch wichtiger ist, dass diese Methode auf Follikel im Frühstadium angewendet werden kann, auch im Stadium der Prävitellogenese. Somit kann diese einfache Methode verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen von Zebrafischen zu trennen.

Introduction

Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Wirbeltierentwicklung und Physiologie. Der Zebrafisch kann als gutes Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Eierstockentwicklung^{dienen 1,2,3}. Viele Merkmale der Eierstockentwicklung sind während der Evolution von Fischen zu Säugetieren sehr erhalten^1,2. Ähnlich wie die anderen Wirbeltiere haben Zebrafische Erwachsene asynchrone Eierstöcke, die Eierstockfollikel aller Entwicklungsstadien enthalten⁴. Der Follikel ist das grundlegende Fortpflanzungselement des Eierstocks. Der Follikel besteht aus der Eizelle, die von einer oder mehreren Schichten somatischer Zellen umgeben ist, die als Follikelzellen bezeichnet werden. Die Entwicklung von Follikel hängt von der bidirektionalen Kommunikation zwischen Eizellen und Follikelzellen^{ab 5}. Es ist wichtig, Follikelzellen und Eizellen von Eierstockfollikel für verschiedene Forschungszwecke wie Follikelzellprimärkultur, Genexpressionsanalyse, Eizellenreifung und In-vitro-Fertilisation zu trennen.

Herkömmliche Trennverfahren umfassen die mechanische Trennung durch Zangen und die enzymatische Verdauung^6,7,8,9,10. Die mechanische Trennung durch Zangen ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. Es wird auch die hohen Schäden an der Oozyte während der Trennung verursachen. Obwohl die Enzymverdauungsmethode einfach zu bedienen ist und eine kurze Zeit erfordert, sollten die Behandlungszeit und die Enzymkonzentration validiert werden, und die Integrität und Überlebensrate der isolierten Eizellen sind nicht ideal. Daher haben wir eine einfache Methode entwickelt, um beide Fächer in verschiedenen Entwicklungsstadien mit gezogenen Glaskapillarrohren zu trennen.

Protocol

Alle Verfahren, die in Fischversuchen durchgeführt werden, entsprechen den Vorschriften der Animal Experimentation Ethics Committee der Northwest Normal University. 1. Vorbereitungen Tiere Verwenden Sie erwachsene weibliche Zebrafische mit einer Körperlänge von 4-6 cm.HINWEIS: Wir haben Zebrafische von einem lokalen Markt verwendet. Halten Sie den Zebrafisch in einem zirkulierenden Wassersystem mit einem 14 h Licht und 10 h dunklen Zyklus bei etwa 28 °C.</l…

Representative Results

Diese Methode kann verwendet werden, um Follikelzellen und Eizellen in verschiedenen Stadien der Eierstockfollikelentwicklung bei Zebrafischen zu trennen. Abbildung 1 zeigt die Trennung von Zebrafisch-Oozyten und Follikelzellen von Eierstockfollikel mit einem Kapillarglasrohr (Abbildung 1). Um zu untersuchen, ob die Follikelzellen von intakten Follikel getrennt waren, wurden die intakten Follikel und die abgetrennten Eizellen aus verschiedenen Follikelstadien vo…

Discussion

Wir beschreiben hier eine neuartige Methode zur einfachen und schnellen Trennung von Follikelzellen und Eizellen von Zebrafisch-Ovarialfollikel. Diese Methode hat gegenüber der herkömmlichen Methode mehrere Vorteile. Dazu gehört vor allem die stark erhöhte Trennungsfreundlichkeit mit hoher Effizienz und Wirksamkeit, da nur eine einzige und externe Manipulation erforderlich ist. Dieser Punkt erhöht die Anwendbarkeit für Forscher, die nicht gut in der mikroskopischen Anatomie sind. Nach unserer Erfahrung kann man Fol…

Materials

17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20