Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

अपडेग्रैफ विधि का उपयोग करके प्लांट बायोमास की क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

अपडेग्रैफ विधि सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। इस प्रदर्शन का मुख्य उद्देश्य संयंत्र बायोमास नमूनों में सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए एक विस्तृत Updegraff प्रोटोकॉल प्रदान करना है।

Abstract

प्रकाश संश्लेषण और सेल दीवारों के मुख्य लोड-असर घटक द्वारा उत्पन्न पृथ्वी पर सेल्यूलोज सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। सेल वॉल कोशिका विकास की ताकत, कठोरता, दर और दिशा प्रदान करके पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, सेल आकार रखरखाव, और जैव और अजैविक तनाव से सुरक्षा। सेल वॉल मुख्य रूप से सेल्यूलोज, लिग्निन, हेमीसेल्यूलोज और पेक्टिन से बना है। हाल ही में संयंत्र सेल दीवारों दूसरी पीढ़ी के जैव ईंधन और जैव ऊर्जा उत्पादन के लिए लक्षित किया गया है । विशेष रूप से, संयंत्र सेल दीवार के सेल्यूलोज घटक का उपयोग सेल्यूलोसिक इथेनॉल के उत्पादन के लिए किया जाता है। बायोमास की सेल्यूलोज सामग्री का आकलन मौलिक और अनुप्रयुक्त सेल दीवार अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है। अपडेग्रैफ विधि पौधे बायोमास की क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए सरल, मजबूत और सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। उपरेफ्रीफ रिएजेंट के साथ उपचार पर अल्कोहल अघुलनशील क्रूड सेल दीवार अंश हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन अंशों को समाप्त करता है। बाद में, अपडेग्रैफ रिएजेंट प्रतिरोधी सेल्यूलोज अंश को मोनोमेरिक ग्लूकोज इकाइयों में सेल्यूलोज होमोपॉलिमर को हाइड्रोलीज़ करने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड उपचार के अधीन किया जाता है। ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके एक प्रतिगमन रेखा विकसित की जाती है और प्रयोगात्मक नमूनों में सेल्यूलोज हाइड्रोलिसिस पर जारी ग्लूकोज की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। अंत में, सेल्यूलोज सामग्री कोलोरिमेट्रिक एंथ्रोन परख द्वारा ग्लूकोज मोनोमर की मात्रा के आधार पर अनुमानित है।

Introduction

सेल्यूलोज सेल दीवारों का प्राथमिक लोड-असर घटक है, जो प्राथमिक और माध्यमिक कोशिका दोनों दीवारों में मौजूद है। सेल वॉल एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स है जो पौधों की कोशिकाओं को घेरे हुए है और मुख्य रूप से सेल्यूलोज, लिग्निन, हेमीसेल्यूलोज, पेक्टिन और मैट्रिक्स प्रोटीन से बना है। लगभग एक तिहाई पौधे बायोमास सेल्यूलोज1 है और यह कोशिका विकास की शक्ति, कठोरता, दर और दिशा प्रदान करके पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सेल आकार रखरखाव, और बायोटिक और अजैविक तनाव से सुरक्षा। कपास फाइबर में 95% सेल्यूलोज2 सामग्री होती है, जबकि पेड़ों में पौधों की प्रजातियों और अंग प्रकार3के आधार पर 40% से 50% सेल्यूलोज होते हैं। सेल्यूलोज सेलोबीओज़ की दोहराने वाली इकाइयों से बना है, जो β-1,4 ग्लाइकोसिडिक बांड4से जुड़े ग्लूकोज अवशेषों का एक डिसाकराइड है। सेल्यूलोसिक इथेनॉल पौधे की कोशिका दीवारों में मौजूद सेल्यूलोज से प्राप्त ग्लूकोज से उत्पन्न होता है5. सेल्यूलोसिक फाइबर कई माइक्रो फिब्रिल से बना होता है जिसमें प्रत्येक माइक्रो फिब्रिल 500-15000 ग्लूकोज मोनोमर1,6के साथ कोर यूनिट के रूप में कार्य करता है। सेल्यूलोज होमोपॉलिमर प्लाज्मा झिल्ली एम्बेडेड सेल्यूलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्स (सीएससी)1, 7द्वारा संश्लेषित कियाजाताहै। व्यक्तिगत सेल्यूलोज सिंथेस ए (सीईएसए) प्रोटीन ग्लूकन चेन और आसन्न ग्लूकन चेन को क्रिस्टलीय सेल्यूलोज1, 8बनाने के लिए हाइड्रोजन बांड से जुड़ेहोतेहैं। सेल्यूलोज दो प्रमुख रूपों, सेल्यूलोज आईα और सेल्यूलोज आई के साथ कई क्रिस्टलीय रूपों में मौजूद है क्योंकि देशी रूप9। उच्च पौधों में, सेल्यूलोज सेल्यूलोज आईए फॉर्म में मौजूद है जबकि निचले पौधे सेल्यूलोज आईα फॉर्म10,11में मौजूद हैं। कुल मिलाकर, सेल्यूलोज पौधे की कोशिका दीवारों को शक्ति और कठोरता प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

पहली पीढ़ी के जैव ईंधन मुख्य रूप से मकई स्टार्च, गन्ना शर्करा, और चुकंदर शर्करा, जो खाद्य स्रोत हैं से उत्पादित कर रहे हैं, जबकि दूसरी पीढ़ी के जैव ईंधन गैर खाद्य संयंत्र बायोमास सेल दीवार सामग्री12से जैव ईंधन उत्पादन पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का सटीक अनुमान न केवल सेल्यूलोज बायोसिंथेसिस और सेल वॉल डायनामिक्स पर मौलिक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है बल्कि एप्लाइड बायोफ्यूल और जैव उत्पादों के अनुसंधान के लिए भी महत्वपूर्ण है। पौधे बायोमास में सेल्यूलोज के अनुमान के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित और अनुकूलित किया गया है, और अपडेग्रैफ विधि सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। सेल्यूलोज अनुमान के लिए पहली रिपोर्ट की गई विधि 190813में क्रॉस और बेवन द्वारा की गई थी। यह विधि सोडियम सल्फेट द्वारा वैकल्पिक क्लोरीनेशन और निष्कर्षण के सिद्धांत पर आधारित थी। हालांकि, क्रॉस और बेवन विधि के मूल और संशोधित प्रोटोकॉलों द्वारा प्राप्त सेल्यूलोज ने काफी मात्रा में जाइलांस और मैनन्स14के अलावा लिग्निन के छोटे अंशों को दूषित दिखाया। सेल्यूलोज अंश से लिग्निन और हेमीसेल्यूलोज को हटाने के लिए कई संशोधनों के बावजूद, क्रॉस-बेवन विधि ने सेल्यूलोज के साथ काफी मात्रा में मैनन बनाए रखा। बाद में, कुर्श्नर की विधि को सेल्यूलोज15निकालने के लिए नाइट्रिक एसिड और इथेनॉल को नियोजित करके विकसित किया गया था। इस विधि में कहा गया है कि कुल लिग्निन और 75% पेंटोसेंट को हटा दिया गया था लेकिन सही सेल्यूलोज परिणाम क्रॉस और बेवन की क्लोरीनेशन विधि द्वारा अनुमानित समान थे। सेल्यूलोज16निकालने के लिए मेथनॉल-बेंजीन, सोडियम सल्फेट और सोडियम हाइपोक्लोराइट को नियोजित करके एक और विधि (नॉर्मन और जेनकिंस) विकसित की गई थी। इस विधि ने लिग्निन के कुछ अंश को भी बनाए रखा (3%) और पेंटोसेंट की महत्वपूर्ण मात्रा सेल्यूलोज के सटीक अनुमान में अग्रणी है। बाद में, किसेल और सेमगनोवस्की ने 80% केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड का उपयोग करके सेल्यूलोज को हाइड्रोलाइज करने के लिए एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग किया, और बर्ट्रेंड की विधि17द्वारा हाइड्रोलिज्ड कम शर्करा का अनुमान लगाया गया था। दो तरीकों, वाकमैन और स्टीवंस18 और सालो14, 19 जो किसेल और सेमीगनोवस्की की विधि के आधार पर विकसित किए गए थे, पहले के तरीकों की तुलना में 4-5% कम सेल्यूलोज सामग्री भी मिली20।

अपडेग्रैफ विधि क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। इस विधि को सबसे पहले उपदेग्रैफ ने 196921में सेल्यूलोज के मापन के लिए वर्णित किया था । अपडेग्रैफ विधि कुछ संशोधनों के साथ कुर्श्नर विधि (नाइट्रिक एसिड का उपयोग), किसेल और सेमिनोस्की विधियों (सल्फ्यूरिक एसिड का उपयोग करके ग्लूकोज मोनोमर में सेल्यूलोज का हाइड्रोलिसिस) और ग्लूकोज और क्रिस्टलीय सेल्यूलोस सामग्री22के सरल रंगमेट्रिक अनुमान के लिए विलेस और सिल्वरमैन की एथ्रोन परख को एकीकृत करती है। इस विधि का सिद्धांत समरूप पौधे के ऊतकों से हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन को खत्म करने के लिए एसिटिक एसिड और नाइट्रिक एसिड (अपडेग्रैफ रिएजेंट) का उपयोग है, जो आगे के प्रसंस्करण और अनुमान15के लिए एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज छोड़ देता है। एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज का इलाज 67% सल्फ्यूरिक एसिड से किया जाता है ताकि सेल्यूलोज को ग्लूकोज मोनोमर में तोड़ दिया जा सके और जारी ग्लूकोज मोनोमर का अनुमान21, 23 को 21,23से किया जाता है । मूल अपडेग्रैफ विधि के कई संशोधनों का उपयोग प्रक्रिया को सरल बनाने और24को परख द्वारा सेल्यूलोज अनुमान को सरल बनाने के लिए किया गया था। मोटे तौर पर इस विधि को पांच चरणों में बांटा जा सकता है। पहले चरण में पौधे की सामग्री तैयार की जाती है। दूसरे चरण में, क्रूड सेल दीवार को कुल बायोमास से अलग किया जाता है, क्योंकि सेल्यूलोज पौधे सेल दीवारों का प्रमुख घटक है। बाद में, तीसरे चरण में, सेल्यूलोज को अपडेग्रैफ रिएजेंट के साथ इलाज करके गैर-सेल्यूलोसिक सेल वॉल घटकों से अलग किया जाता है। चौथे चरण में एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज को सल्फ्यूरिक एसिड ट्रीटमेंट से ग्लूकोज मोनोमर में तोड़ दिया जाता है। सेल्यूलोज के सल्फ्यूरिक एसिड उपचार के परिणामस्वरूप सल्फ्यूरिक एसिड के साथ ग्लूकोज मोनोमर की प्रतिक्रिया से 5-हाइड्रोक्सीमिथाइलफ्यूरल यौगिकों का गठन होता है। अंत में, अंतिम चरण में, एंथ्रोन पिछले चरण25में उत्पन्न फरफ्यूरल यौगिक के साथ उबलते हुए एक हरे नीले रंग का परिसर उत्पन्न करता है। इस अत्यावन आधारित रंगीन विधि का उपयोग पहली बार ड्रेवुड द्वारा 1 9 42 में किया गया था। एंथ्रोन एक डाई है जो अम्लीय परिस्थितियों में पेंटोज और हेक्सोस निर्जलित उत्पादों जैसे 5-हाइड्रोक्सीमिथाइलफुरल के फर्फुरल यौगिकों की पहचान करती है। हेक्सोस के साथ प्रतिक्रिया पेंटोस25की तुलना में एक तीव्र रंग और बेहतर प्रतिक्रिया पैदा करती है। बाउंड ग्लूकोज की मात्रा 620 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर अवशोषण द्वारा मापी जाती है और हरे नीले परिसर की तीव्रता सीधे नमूने में चीनी की मात्रा के आनुपातिक होती है। मापा अवशोषण मूल्यों के नमूने के ग्लूकोज एकाग्रता की गणना करने के लिए एक ग्लूकोज मानक वक्र प्रतिगमन लाइन के साथ तुलना की गई । मापा ग्लूकोज सामग्री संयंत्र बायोमास के सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. सूखे पौधे की सामग्री को बारीक पाउडर में पीस लें।
  2. प्रोटीन सोल्यूबिलाइजेशन बफर (पीएसबी): 1 एम ट्रिस (पीएच 8.8), 0.5 एम एथिलेंडाइमाएंट्रेएक्टिक एसिड (ईडीटीए) (पीएच 8.0) के स्टॉक समाधान तैयार करें और उन्हें ऑटोक्लेव करें। बाँझ पानी में 50 एमएम ट्रिस, 0.5 एमएम ईडीए और 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की अंतिम सांद्रता के साथ इन स्टॉक समाधानों से ताजा पीएसबी बफर बनाएं।
  3. 70% इथेनॉल (v/v): 100% इथेनॉल की 70 मिलील और बाँझ पानी की 30 मिलील तैयार करें।
  4. मेथनॉल के 100 एमएल तैयार करें: 1:1 अनुपात में क्लोरोफॉर्म (50 एमएल मेथनॉल और 50 एमएल क्लोरोफॉर्म)।
  5. 82.5 एमएल अपडिग्र्फ रिएजेंट तैयार करें। नाइट्रिक एसिड के 7.5 एमएल में 80% एसिटिक एसिड का 75 एमएल जोड़ें ताकि पानी का अंतिम अनुपात: एसिटिक एसिड: नाइट्रिक एसिड 2:8:1 (v/v) में है। 80% एसिटिक एसिड तैयार करने के लिए, 20 मिलील बाँझ पानी (v/v) में हिमनदों एसिटिक एसिड के 80 मिलील घोलें।
  6. 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज घोल का नए सिरे से स्टॉक तैयार करें। 10 मिलीग्राम ग्लूकोज को 10 एमएल पानी (w/v) में घोलें।
  7. 67% सल्फ्यूरिक एसिड (v/v) के 100 एमएल तैयार करने के लिए, 33 एमएल पानी में 67 एमएल केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड जोड़ें। हमेशा कांच की बोतल का इस्तेमाल करें और पानी में धीरे-धीरे एसिड डालें। यह कदम एक्सोथर्मिक (रिलीज गर्मी) है। इसलिए, इस घोल को बर्फ पर तैयार करें और उपयोग से कम से कम 2 घंटे पहले फ्रिज में ठंडा करें।
  8. प्रत्येक बैच के प्रायोगिक नमूनों के लिए नए सिरे से 0.2% ththrone (w/v) तैयार करें। 0.2 ग्राम एंथ्रोन का वजन करें और एल्यूमीनियम फॉयल से लिपटे कांच की बोतल में पूर्व-ठंडा केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड के 100 मिलील में भंग करें। उपयोग से पहले 1-2 घंटे के लिए फ्रिज में रखें।
    नोट: प्रयोग के दिन रेफ्रिजरेटर में प्री-चिलिंग केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड, और ग्लूकोज सामग्री के सटीक अनुमान के लिए एंथ्रोन की ताजा तैयारी की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

2. पौधे बायोमास सामग्री की तैयारी

  1. एक ही विकास की स्थिति के साथ ग्रीनहाउस में उगाई जाने वाली 2 महीने पुरानी कपास प्रायोगिक लाइनों से पौधे बायोमास के नमूने एकत्र करें, एक ही विकास चरण, पौधों की एक ही स्थिति और एक ही प्रकार के ऊतक (पत्ती/स्टेम/रूट) ।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए न्यूनतम तीन जैविक प्रतिकृति एकत्र करें। जड़ के ऊतकों से सभी गंदगी को हटाने के लिए उन्हें पानी से अच्छी तरह धोएं।
  2. नमी की मात्रा(चित्रा 1)को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर कागज तौलिए पर 2 दिनों के लिए हवा-शुष्क जड़ ऊतक ।
    नोट: किसी भी कवक संदूषण को रोकने के लिए सेल्यूलोज अनुमान के लिए हवा-शुष्क वांछित ऊतक।
  3. रूट के नमूनों को अलग-अलग कंटेनरों में रखें। फिर उन्हें इनक्यूबेटर में 10 दिनों(सामग्रियों की तालिका)के लिए 49 डिग्री सेल्सियस पर लेबल और सुखा दें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक फ्रीज ड्रायर संयंत्र बायोमास सामग्री के लिए किसी भी रासायनिक परिवर्तन के कारण के बिना कम समय (1 या 2 दिन) में संयंत्र के ऊतकों को सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. सूखे नमूनों को छोटे टुकड़ों में काटें, उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें, और मोर्टार और मूसल, फ्रीजर मिल, या बायोमास ग्राइंडर(चित्रा 1)का उपयोग करके एक समान ठीक पाउडर में पीस लें।
    नोट: फ्रीजर मिल 3 चक्रों के लिए 10 सीपीएस की दर से इस्तेमाल किया गया था ।
  5. ग्राउंडेड टिश्यू(चित्रा 2)लीजिए और सेल वॉल एक्सट्रैक्टिंग के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: कमरे के तापमान पर एयरटाइट कंटेनरों में नमूनों को संग्रहीत करके इस प्रक्रिया को इस बिंदु पर रोका जा सकता है।

3. संयंत्र बायोमास से कच्चे सेल की दीवारों का निष्कर्षण

नोट: संयंत्र सेल की दीवारों में सेल्यूलोज, लिग्निन, गैर-सेल्यूलोज घटक, पेक्टिन, मैट्रिक्स प्रोटीन, फेनोलिक यौगिक और पानी26होते हैं। चूंकि सेल्यूलोज सेल की दीवारों में मौजूद है, इसलिए पहला कदम संयंत्र बायोमास26के गैर-सेल दीवार घटकों से सेल वॉल घटक को अलग करना है।

  1. सेल वॉल एक्सट्रैक्टिंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले अलग-अलग ब्लैंक 2 एमएल ट्यूब को लेबल और वजन करें।
  2. आगे बढ़ने से पहले लैब नोटबुक में खाली ट्यूब वजन का नोट बना लें।
  3. स्टेप 2.5 से 20 मिलीग्राम पाउडर टिश्यू का वजन करें और इसे पूर्व-तौला 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें लेबल करें।
  4. प्रोटीन घुलनशीलता बफर (पीएसबी) (50 mM Tris हाइड्रोक्लोराइड (एचसीएल) बफर पीएच 8.8, 0.5 एमएम ईडीटीए, और 10% सोडियम डॉडिल सल्फेट (एसडीएस) को प्रोटीन को घुलनशील करने के लिए जोड़ें। भंवर और अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान (आर टी) पर 5 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम पर। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और गोली को बचाएं।
    नोट: यदि प्रोटीन घटक का विश्लेषण करने की आवश्यकता है तो सुपरनैंट को बचाया जा सकता है।
  5. दो बार 3.4 कदम दोहराएं।
  6. बनाए गए गोली में 1 एमएल आसुत पानी और भंवर डालें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनैंट को हटा दें।
  7. दो बार 3.6 कदम दोहराएं।
  8. सहेजे गए गोली, भंवर में 70% इथेनॉल का 1 एमएल जोड़ें और नमूनों से घुलनशील घटकों और स्टार्च को हटाने के लिए पानी के स्नान/हीट ब्लॉक में 1 घंटे के लिए इसे 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। भंवर और अपकेंद्रित्र आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम पर। सुपरनेट को त्यागें और गोली को बचाएं।
  9. दोहराएं चरण 3.8 एक बार और।
  10. गोली के लिए 100% मेथनॉल और भंवर के 1 मिलील जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनैंट को हटा दें।
  11. गोली और भंवर में क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल 1:1 अनुपात में) की 1 एमएल जोड़ें। आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 x g पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म सॉल्वेंट घुलोबिलाइज के अलावा बायोमास27से लिपिड अंश को हटा देता है ।
  12. गोली के लिए, 100% एसीटोन और भंवर के 1 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 x g पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को हटा दें। एसीटोन28 , 29बायोमास से क्लोरोफिल और मुक्त फैटी एसिड जैसे पिगमेंट को हटा देता है ।
  13. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर गोली को सुखाएं या वैक्यूम सुखाने से आगे बढ़ें।
    नोट: सूखे गोली क्रूड सेल क्रिस्टलीय सेल्यूलोज अनुमान के लिए इस्तेमाल की दीवार है । प्रक्रिया को इस बिंदु पर रोका जा सकता है या नमूनों को सुखाने के लिए वैक्यूम सुखाने का उपयोग करके आगे बढ़ना।

4. गैर-सेल्यूलोसिक घटकों को हटाने के लिए अपडेग्रैफ रिएजेंट (एसिटिक और नाइट्रिक एसिड) के साथ उपचार

नोट: प्रोटोकॉल एसिड और अन्य रसायनों का उपयोग शामिल है। इस प्रक्रिया के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।

  1. सूखे कच्चे सेल दीवार गोली के 5 मिलीग्राम को एक ताजा 2 एमएल स्क्रू कैप्ड ट्यूब में मापें। सही वजन पर ध्यान दें (चित्र 3)30.
  2. इस बिंदु पर एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करें। 80% सेल्यूलोज सामग्री की पैदावार वाले सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 2 मिलीग्राम फिल्टर पेपर(सामग्री की तालिका)का उपयोग करें।
  3. तौला 5 मिलीग्राम सेल वॉल एक्सट्रैक्ट और पॉजिटिव कंट्रोल में अपडिग्र्फ रिएजेंट का 1.5 एमएल जोड़ें। भंवर से मिलाएं।
    नोट: सकारात्मक नियंत्रण इस कदम के बाद से प्रयोगात्मक नमूनों के रूप में उसी तरह से संसाधित किया जाना चाहिए । यह कदम उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ धुएं हुड में किया जाना चाहिए।
    सावधानी: यह कदम स्क्रू कैप ट्यूबों में किया जाना चाहिए ताकि ट्यूबों के नमूने और पॉपिंग के छिड़काव को रोका जा सके। सकारात्मक नियंत्रण के लिए तीन प्रतिकृति के साथ प्रत्येक नमूने के तीन जैविक प्रतिकृति शामिल किया जाना चाहिए ।
  4. एक उबलते पानी स्नान में 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन गर्म करें और 10 मिनट के लिए एक बेंच पर ठंडा करें। आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x g पर सेंट्रलाइज करें। अपकेंद्रित्र द्वारा सुपरनेट को हटाएं और गोली को बचाएं।
    नोट: उत्पन्न अपशिष्ट को कार्बनिक सॉल्वैंट्स, सल्फ्यूरिक एसिड, और अपडेग्रैफ रिएजेंट (एसिटिक एसिड और नाइट्रिक एसिड) के लिए अलग से एकत्र किया जाना चाहिए। एसिटिक एसिड और नाइट्रिक एसिड के साथ अपशिष्ट हवादार टोपियां के साथ शांत तापमान पर रखा जाना चाहिए और किसी भी विस्फोट को रोकने के लिए किसी भी अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स और अन्य एसिड के साथ कभी नहीं मिलाया जाना चाहिए।
  5. गोली में 1 एमएल पानी डालें। आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x g पर सेंट्रलाइज करें। 500 माइक्रोन सुपरनेट को निकालें और ट्यूब में एसीटोन का 1 मिलियन डालें।
  6. आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। 1 एमएल सुपरनैंट को हटाएं, और आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 एक्स ग्राम पर ट्यूब और सेंट्रलाइज में एसीटोन का 1 एमएल जोड़ें।
  7. अपकेंद्रित्र के बाद, सभी सुपरनेट को हटा दें और एसीटोन के 1 एमएल में गोली को निलंबित करें। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें और आरटी में 5 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम पर स्पिन करें।
  8. सुपरनेट को त्यागें और गोली को बचाएं। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर गोलीसुखाएं (चित्र 3)।
    नोट: इस प्रक्रिया को इस बिंदु पर रोका जा सकता है या सुखाने के लिए वैक्यूम सुखाने का उपयोग करके आगे जारी रखा जा सकता है और अगले चरण में आगे बढ़ना है।

5. ग्लूकोज मोनोमर इकाइयों का उत्पादन करने के लिए एसिड द्वारा सेल्यूलोज का हाइड्रोलिसिस

  1. सूखे गोली में 67% सल्फ्यूरिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें। भंवर पूरी तरह से एसिड में गोली मिश्रण करने के लिए।
  2. 67% सल्फ्यूरिक एसिड में सेल्यूलोज गोली को भंग करने के लिए 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब हिलाएं।
    नोट: एक विकल्प के रूप में, 67% सल्फ्यूरिक एसिड में सेल्यूलोज गोली के घुलनशीलीकरण को शेकर में 30 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद 10 मिनट के लिए प्रत्येक नमूने के सोनिकेशन द्वारा सुधारा जा सकता है। सोनीफिकेशन के बाद आरटी में शेकर में सैंपल फिर से इनक्यूबेटेड किए जा सकते हैं। हालांकि, हमने 5 मिलीग्राम क्रूड सेल वॉल एक्सट्रैक्ट(चित्र 3)के साथ शुरू होने पर सोनीशन के बिना सेल्यूलोज पेलेट की पूरी घुलनशीलता देखी। यह प्रक्रिया विभिन्न पौधों के बायोमास नमूनों के लिए अच्छी तरह से काम करती है3.

6. एंथ्रोन परख और सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान से ग्लूकोज सामग्री को मापने

  1. इस स्तर पर, सेल्यूलोज मुफ्त ग्लूकोज मोनोमर के रूप में है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा नमूने में मौजूद ग्लूकोज की मात्रा को मापकर सेल्यूलोज की मात्रा निर्धारित करें।
  2. स्टेप 5 से सैंपल का 10 माइक्रोन लें और 500 माइक्रोन में प्रत्येक सैंपल को कमजोर करने के लिए इसे 490 माइक्रोन बाँझ डिस्टिल्ड पानी में डालें। भंवर 10 सेकंड के लिए सैंपल और पानी का पतला मिश्रण।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 0.2% ताजा तैयार एंथ्रोन रिएजेंट के 1 मिलियन जोड़ें और भंवर द्वारा तुरंत मिलाएं।
  4. 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूने उबालें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों को ठंडा करें। एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के तीन कुओं में प्रत्येक नमूने के 200 μL स्थानांतरण। 620 एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए 96 अच्छी प्लेट को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में लोड करें।
    नोट: उच्च तापमान पर उबलने के लिए, हानिकारक रसायनों के छिड़काव को रोकने और नमूनों के नुकसान से बचने के लिए स्क्रू-कैप्ड ट्यूबों का उपयोग करें।

7. ग्लूकोज मानक वक्र की तैयारी

  1. ग्लूकोज स्टैंडर्ड तैयार करने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज का 10 मिलीग्राम ग्लूकोज को 10 एमएल बाँझ डिस्टिल्ड पानी में घोलकर नए सिरे से स्टॉक करें। 20 माइक्रोल वेतन वृद्धि में 1 मिलीग्राम/एमएल के इस स्टॉक समाधान जोड़ें (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 माइक्रोन) बाँझ आसुत पानी (कुल मात्रा 1 mL) के लिए 0 μg से 180 μg/mL सांद्रता(चित्रा 3)से लेकर ग्लूकोज मानकों को तैयार करने के लिए । बाँझ पानी जोड़ने के बाद प्रत्येक ग्लूकोज मानक भंवर।
  2. इन 10 अलग-अलग सांद्रता से, प्रत्येक ग्लूकोज एकाग्रता के 500 माइक्रोन को एक ताजा 2 एमएल स्क्रू कैप्ड ट्यूब में।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल का ताजा तैयार 0.2% एंथ्रोन जोड़ें और भंवर से तुरंत मिलाएं। बर्फ पर इनक्यूबेट और 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबाल और उसके बाद 5 मिनट23के लिए बर्फ पर इनक्यूबेशन ।
  4. तीन तकनीकी प्रतिकृति के लिए एक 96 अच्छी तरह से माइक्रो टाइटर प्लेट में तीन कुओं के लिए प्रत्येक मानक के 200 μL हस्तांतरण और 620 एनएम(चित्रा 3)पर अवशोषण को मापने।
  5. 620 एनएम(चित्रा 7)पर सामान्यीकृत अवशोषण मूल्यों के खिलाफ विभिन्न ग्लूकोज सांद्रता (0 से 180 μg/l) की साजिश रचकर एक मानक ग्लूकोज वक्र विकसित करें। तैयार नमूनों में सेल्यूलोज सामग्री की गणना करने के लिए अवशोषण मूल्यों से उत्पन्न प्रतिगमन रेखा वाई = एमएक्स + सी का उपयोग करें।
    नोट: ग्लूकोज मानकों हौसले से प्रयोग के प्रत्येक सेट के लिए तैयार किया जाना चाहिए । यदि ओडी मान बहुत अधिक हैं/ प्रतिगमन रेखा नमूनों के प्रत्येक बैच के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लूकोज मानकों के आधार पर विभिन्न एम और सी मूल्य उत्पन्न करती है। 23को मिलाने के तुरंत बाद ट्यूब मिलाएं । इस प्रतिक्रिया की एक्सोथर्मिक प्रकृति के कारण एथॉन, पतला नमूने और तैयार मानकों को हमेशा ठंडा रखा जाता था जब तक कि इस प्रतिक्रिया की एक्सोथर्मिक प्रकृति के कारण मानवस्थित परख नहीं की जाती थी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस अध्ययन के लिए ग्रीन हाउस में उगाए जाने वाले कपास के पौधों का चयन किया गया। सेल्यूलोज सामग्री के तुलनात्मक विश्लेषण के लिए कपास की दो अलग-अलग प्रायोगिक लाइनों का चयन किया गया था। प्रत्येक प्रायोगिक रेखा के लिए, रूट ऊतक तीन जैविक प्रतिकृति से एकत्र किया गया था। कुल 500 मिलीग्राम ऊतक समरूप था और 20 मिलीग्राम इसका उपयोग क्रूड सेल वॉल निकालने के लिए किया गया था। बाद में, सेल्यूलोज से हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन को हटाने के लिए अपडेग्रैफ रिएजेंट ट्रीटमेंट के लिए 5 मिलीग्राम क्रूड सेल वॉल एक्सट्रैक्ट का इस्तेमाल किया गया। शुद्ध सेल्यूलोज को ग्लूकोज इकाइयों में सेल्यूलोज को तोड़ने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड उपचार द्वारा हाइड्रोलाइज किया गया था। 620 एनएम(अनुपूरक तालिका 1)पर अवशोषण रीडिंग के परिणामों का उपयोग ग्लूकोज एकाग्रता को मापने और एंथ्रोन परख द्वारा सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। 0 माइक्रोन ग्लूकोज एकाग्रता के खाली अवशोषण मूल्य को घटाकर तीन तकनीकी प्रतिकृति के औसत अवशोषण मूल्यों को सामान्य बनाया गया था। ग्लूकोज मानक वक्र एक बिखरे हुए बार ग्राफ(चित्रा 4)का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था।

परिणामी प्रतिगमन रेखा, वाई = एमएक्स + सी इस मानक वक्र से, सामान्यीकृत अवशोषण रीडिंग का उपयोग करके निकाले गए परीक्षण नमूनों में अज्ञात ग्लूकोज एकाग्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक्स (μg/μL में अज्ञात ग्लूकोज एकाग्रता) की गणना करने के लिए, सूत्र (x= सामान्यीकृत अवशोषण-c/m) का उपयोग किया गया था। मानक ग्लूकोज वक्र (आर 2 =0.99) के प्रतिगमन रेखा से सी और एम मानों का उपयोग μg/μL में ग्लूकोज एकाग्रता को मापने के लिए किया गया था। फिर इस मूल्य को 2 के कमजोर पड़ने वाले कारक से विभाजित किया जाता है क्योंकि अंतिम मात्रा 500 माइक्रोन होती है और आगे μg/μL में ग्लूकोज एकाग्रता को मापने के लिए 10 माइक्रोन नमूना मात्रा से विभाजित होती है। चूंकि गणना मूल्य सेल दीवार निकालने के 5 मिलीग्राम के लिए है, यह आगे 5 से विभाजित है या संबंधित कच्चे तेल की सेल दीवार वजन प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए इस्तेमाल के लिए प्रति मिलीग्राम ग्लूकोज एकाग्रता पाने के लिए । हाइड्रोलिसिस की प्रक्रिया में प्राप्त पानी की भरपाई के लिए मूल्य को 1.1 से विभाजित किया गया है (ग्लूकोज का आणविक वजन 180 है और पानी के अणु का आणविक वजन 18 है और इसलिए ग्लूकोज मोनोमर को छोड़ने की प्रक्रिया में उत्पन्न पानी को नमी कारक, 1.1 को विभाजित करके हटा दिया गया था)। परिणामी मूल्य को प्रतिशत(अनुपूरक तालिका1) में क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री की गणना करने के लिए 100 से गुणा किया जाएगा।

सेल्यूलोज सामग्री के परिणाम बताते हैं कि वे जैविक प्रतिकृति के बीच संगत हैं, जो अपडेग्रैफ विधि की तकनीकी सटीकता का सुझाव देते हैं। इसके अलावा, 2D रेखांकन का उपयोग करके मतभेदों को प्लॉट किया गया था। इन परिणामों की तुलना में प्रयोगात्मक नमूना संख्या 1 और 2(चित्रा 4)में सेल्यूलोज सामग्री अंतर दिखाया । नमूना 1 43.4% दिखाता है जबकि नमूना 2 28.12% दिखाता है, यह सुझाव देता है कि यह विधि प्रायोगिक नमूनों के बीच मतभेदों को अलग कर सकती है। एक छात्र टी परीक्षण ९५% महत्व स्तर पर लागू करने के लिए अपने महत्वपूर्ण मतभेदों का परीक्षण किया गया ।

Figure 1
चित्रा 1:जड़ों में सेल्यूलोज सामग्री अनुमान के लिए कपास संयंत्र बायोमास की तैयारी। (A)ग्रीनहाउस उगाए गए पौधों को धीरे से मिट्टी से खींचा जाता था और पानी से अच्छी तरह से धोया जाता था । पौधे की जड़ ऊतक अलग हो गया था, कागज तौलिए पर रखा गया था और 2 दिनों के लिए सूखी हवा की अनुमति दी गई थी। (ख)फिर रूट टिश्यू को व्यक्तिगत रूप से लेबल किए गए कंटेनरों में स्थानांतरित कर दिया गया और -10 दिनों के लिए 49 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सूखने की अनुमति दी गई। (ग)सूखे ऊतक को छोटे टुकड़ों में काटा गया था, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, पीसने वाली शीशियों में लोड किया गया था, और फ्रीजर मिल का उपयोग करके ठीक पाउडर में उड़ान भरी थी । (घ)50 एमएल ट्यूब में बारीक ग्राउंडेड टिश्यू पाउडर एकत्र किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:अपडेग्रैफ विधि में शामिल मुख्य चरणों का प्रवाह चार्ट। (A)प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों का सचित्र प्रतिनिधित्व। (ख)पैनल(ए)में दिखाए गए महत्वपूर्ण कदमों के बारे में बताते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-मानक वक्र के लिए ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता तैयार करना। (ए)बाँझ आसुत पानी के 10 एमएल में 10 मिलीग्राम ग्लूकोज को घोलकर ग्लूकोज का स्टॉक समाधान तैयार करें ताकि स्टॉक की अंतिम सांद्रता 1 मिलीग्राम/एमएल हो। 0 माइक्रोग्राम से 180 माइक्रोग्राम/एमएल तक ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता तैयार करने के लिए बाँझ आसुत पानी के साथ 1 मिलीग्राम/μL वेतन वृद्धि में 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज का स्टॉक समाधान जोड़ें । (ख)ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता बनाने के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज और बाँझ आसुत पानी की मात्रा को दिखाने वाली तालिका । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:ग्लूकोज मानक वक्र 620 एनएम पर विभिन्न ग्लूकोज सांद्रता के अवशोषण मूल्यों का उपयोग कर उत्पन्न होता है। (ए)तालिका में ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता 0 से 180 माइक्रोग्राम/एमएल तक 620 एनएम पर संबंधित सामान्यकृत अवशोषण मूल्यों के साथ दिखाई देती है। (ख)ग्लूकोज मानक वक्र अवशोषण मूल्यों(ए)से एक तितर बितर चार्ट का उपयोग कर उत्पन्न । (ग)प्रयोगात्मक नमूनों में क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अंतर को दर्शाने वाले बार ग्राफ 1 और 2 । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: प्रायोगिक नमूनों में सेल्यूलोज सामग्री का आकलन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कॉटन फाइबर कॉटनसीज से उत्पादित प्राकृतिक फाइबर होते हैं। कॉटन फाइबर एक एकल सेल है जिसमें ~ 95% सेल्यूलोज सामग्री2 है जिसमें उच्च क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री है जिसमें कपड़ा उद्योग31में व्यापक अनुप्रयोगों के साथ है। के रूप में, कपास फाइबर ~95% सेल्यूलोज होते हैं, हम क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के प्रदर्शन के लिए कपास जड़ ऊतकों का इस्तेमाल किया है। कपास जड़ ऊतक क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री में मामूली रूप से समृद्ध होते हैं और आमतौर पर उपलब्ध पौधे बायोमास का प्रतिनिधित्व करते हैं। क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के लिए आवश्यक कुल सेल दीवार की मात्रा केवल 5 मिलीग्राम है और इसलिए इस विधि को विभिन्न विकासात्मक चरणों/ऊतक विशिष्ट सेल्यूलोज सामग्री अनुमान में क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का आकलन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । सल्फ्यूरिक एसिड का प्रतिशत (67%) इसके अलावा ग्लूकोज मोनोमर में सेल्यूलोज तोड़ने और सोनीशन की आवश्यकता के बिना पूरी तरह से23 सेल्यूलोज भंग करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। नमूना हानि अपडेग्रैफ उपचार के बाद आम है क्योंकि क्रिस्टलीय सेल्यूलोज गोली अनुमान प्रक्रिया में विभिन्न चरणों में ट्यूब के तल पर ठोस नहीं है। यह पानी के प्रत्येक चरण में सुपरनिटेंट की छोटी मात्रा को हटाकर और अपडेग्रैफ उपचार के बाद एसीटोन वॉश को कम किया जा सकता है। इसके अलावा, नमूने के तत्काल भंवर और मानवस्थित मानकों के साथ रंग विकास और मानकों की बढ़ती सटीकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिससे दृढ़ संकल्प (आर 2) मूल्यों(चित्र 3)का99.5%गुणांक होता है। ग्लूकोज मानक वक्र ग्लूकोज एकाग्रता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है, जिसका उपयोग क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। इसलिए, ग्लूकोज की सांद्रता को सांद्रता की आवश्यक सीमा के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। प्रायोगिक मूल्यों को फिट करने के लिए मूल्यों की सीमा के आधार पर, मानक वक्र ग्लूकोज की 1000 μg/ml या 0 से 200 μg/mL तक 1000 μg/mL सांद्रता तक हो सकता है; यह प्रतिगमन मूल्यों सी और एम को बदलता है, क्रिस्टलीय सेल्यूलोज अनुमान की सटीकता में सुधार करता है। यह हमेशा दोनों नमूनों के लिए और साथ ही मानक के लिए ताजा 0.2% anthrone बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। आर-स्क्वायर, एक सांख्यिकीय माप, प्रतिगमन रेखा पर सभी डेटा बिंदुओं की परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व करता है। एक ही समय के लिए सिंहासन जोड़ने के बाद मानकों और नमूनों दोनों को उबालना महत्वपूर्ण है। एक ज्ञात सेल्यूलोज सामग्री के साथ सकारात्मक नियंत्रण शामिल करना हमेशा महत्वपूर्ण होता है। प्रभावी डेटा प्रजनन क्षमता के लिए, समाधान तैयारी (मानक, मानक वक्र और Updegraff reagent) सहित पूरी प्रक्रिया का सही पालन किया जाना चाहिए।

हाल ही में, सेल्यूलोसिक एयरोसोल, कंप्यूटर पार्ट्स और सेल्यूलोसिक इथेनॉल32, 33जैसे गैर-वस्त्र अनुप्रयोगों के लिए सेल्यूलोज का पता लगायाजाताहै; इसलिए, इस विधि में भविष्य में व्यापक अनुप्रयोग होंगे। अवधारणाओं को समझने, वैकल्पिक परिकल्पनाओं का प्रस्ताव करने और मौजूदा ज्ञान को प्रदान करने/अस्वीकार करने में वृद्धिशील प्रगति के माध्यम से वैज्ञानिक उन्नति की जाती है । इसी तरह की प्रगति संयंत्र बायोमास में सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए एक विश्वसनीय विधि के विकास में देखी जा सकती है। सेल वॉल एक जटिल मैट्रिक्स है और अपडेग्रैफ विधि एक अनुक्रमिक तरीके से शुद्ध सेल्यूलोज से गैर-सेल्यूलोज अंशों को समाप्त करती है, जिससे पौधे बायोमास में सेल्यूलोज सामग्री का सटीक अनुमान होता है। इसके अलावा, ग्लूकोज एकाग्रता को मापने के द्वारा सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए विकसित सरल रंग-रोगन विधि ने इस विधि को अत्यधिक अनुकूलनीय और व्यापक रूप से उपयोग किया। वर्तमान अध्ययन में, सेल्यूलोज डेटा एक ही पंक्ति से एकत्र नमूनों की विभिन्न जैविक प्रतिकृति के बीच संगत था। इस प्रकार, यह पता चलता है कि इस विधि द्वारा उत्पादित डेटा सरल रंग-मित्रिक परख द्वारा सेल्यूलोज सामग्री को मापने के लिए सुसंगत, विश्वसनीय, प्रजनन योग्य और आसान है।

अपडेग्रैफ विधि सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। भोजन, लकड़ी, कागज, फाइबर, जैव ईंधन, कपड़े, कॉस्मेटिक और फार्मास्यूटिकल्स जैसे सेल्यूलोज के औद्योगिक अनुप्रयोग के हालिया विस्तार के साथ, पौधे बायोमास की सेल्यूलोज सामग्री का सटीक अनुमान विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि यह सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, लेकिन प्रजनन योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए कई सावधानियां बरतना महत्वपूर्ण है। बायोमास के नमूनों को सेल्यूलोज सामग्री का सटीक और प्रजनन अनुमान प्राप्त करने के लिए एक ही आकार के लिए जमीन होनी चाहिए। ग्लूकोज मानक वक्र पैदा करते समय देखभाल की जानी चाहिए। ग्लूकोज मानक वक्र तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लूकोज मानकों को नमूना अवशोषण रीडिंग के आधार पर बढ़ाया या कम किया जाना चाहिए ताकि अज्ञात सांद्रता ग्लूकोज सांद्रता की सीमा के भीतर आती है जिसका उपयोग मानक वक्र तैयार करने के लिए किया जाता है। यदि नहीं, तो एम और सी मान भिन्न हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का गलत अनुमान हो सकता है। नमूनों के प्रत्येक बैच के लिए 0.2% एंथ्रोन की ताजा तैयारी Updegraff विधि का एक और महत्वपूर्ण कदम है। सेल्यूलोज सामग्री के सटीक अनुमान के लिए ताजा तैयार 0.2% एंथ्रोन का उपयोग करना आवश्यक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के आंशिक समर्थन के लिए संयंत्र और मृदा विज्ञान और कपास इंक विभाग को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 171 सेल वॉल बायोमास सेल्यूलोज हेमीसेल्यूलोज लिग्निन हेमीसेलुलोज और एंथ्रोन परख
अपडेग्रैफ विधि का उपयोग करके प्लांट बायोमास की क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter