זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.
Abstract
תולעת הכותנה, הליקוברפה ארמיגרה, היא אחד המזיקים ההרסניים ביותר בעולם. שילוב של גנטיקה מולקולרית, פיזיולוגיה, גנומיקה תפקודית ומחקרים התנהגותיים הפך את H. armigera למין מודל ב- Lepidoptera Noctuidae. כדי לחקור את הפונקציות in vivo של ואינטראקציות בין גנים שונים, מקובצים באופן קבוע interspaceed חזרות פלינדרומיות קצרות (CRISPR)/ הקשורים חלבון 9 (Cas9) טכנולוגיית עריכת גנום היא שיטה נוחה ויעילה המשמשת לביצוע מחקרים גנומיים פונקציונליים. במחקר זה, אנו מספקים שיטה שיטתית שלב אחר שלב כדי להשלים נוקאאוט גנים ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. העיצוב והסינתזה של מדריך RNA (gRNA) מתוארים בפירוט. לאחר מכן, השלבים הבאים המורכבים מתכנון פריימר ספציפי לגנים ליצירת RNA מדריך (gRNA), איסוף עוברים, מיקרו-גירוי, גידול חרקים וזיהוי מוטציות מסוכמים. לבסוף, עצות והערות לפתרון בעיות מסופקות כדי לשפר את היעילות של עריכת גנים. השיטה שלנו תשמש התייחסות ליישום של עריכת גנום CRISPR / Cas9 ב H. armigera , כמו גם עשים אחרים Lepidopteran.
Introduction
היישום של טכנולוגיית עריכת הגנום מספק כלי יעיל להשגת מוטציות גן יעד במינים מגוונים. הופעתה של מערכת החזרות הפלינדרומיות הקצרות המקובצות באופן קבוע (CRISPR)/חלבון קשור 9 (Cas9) מספקת שיטה חדשנית לתפעול הגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכבת מ-RNA מדריך (gRNA) ו-Cas9 endonuclease2,3, בעוד שניתן לחלק עוד יותר את ה-gRNA לשני חלקים, RNA CRISPR משלים מטרה (crRNA) וקרנ”א טרנס-הפעלה (tracrRNA). ה- gRNA משתלב עם אנדונוקלאז Cas9 ויוצר ריבונוקלאופרוטאין (RNP). עם gRNA, ניתן להפנות אנדונוקלאז Cas9 לאתר מסוים של הגנום באמצעות השלמת בסיס. תחומי RuvC ו- HNH של ה- Cas9 מבקעים את אתר היעד של הגנום שלושה בסיסים לפני רצף המוטיב הסמוך לפרוטו-חלל (PAM) ויוצרים הפסקה כפולת גדילים (DSB). לאחר מכן ניתן לתקן את מחשוף ה- DNA באמצעות שני מנגנונים, צירוף קצה לא הומולוגי (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)4. תיקון של DSB מציג הוספות או מחיקות כדרך להשבית את הגן הממוקד, שעלול לגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. לפיכך, הגילוי והספציפיות של מערכת CRISPR/Cas9 הופכים אותה לשיטה חזקה לאפיון פונקציות גנים ב- vivo ולניתוח אינטראקציות גנים5.
עם יתרונות רבים, מערכת CRISPR/Cas9 יושמה בתחומים שונים, כולל ביו-רפואה6,7, טיפול גנטי8,9 וחקלאות10,11,12, ושימשה למערכות ביולוגיות שונות כולל מיקרואורגניזמים13, צמחים14,15, נמטודות16 , ויונקים17 . אצל חסרי חוליות, מינים רבים של חרקים נחשפו לעריכת גנום CRISPR/Cas9, כגון זבוב הפירות Drosophila melanogaster ומעבר ל-18,19,20,20,21,22.
ארמיגרה הליקוברפה הוא אחד המזיקים ההרסניים ביותר ברחבי העולם23, ופוגע ביבולים רבים, כולל כותנה, פולי סויה וסורגום24,25. עם התפתחות טכנולוגיית הרצף, הגנום של H. armigera, כמו גם של מגוון של מיני חרקים לפידופטרה, כבר רצף לחלוטין 26,27,28,29. מספר רב של גנים של התנגדות קולטן חוש הריח זוהו ואופיינו מחרקים אלה בשנים האחרונות19,27,28,29. כמה גנים הקשורים להתנגדות זוהו H. armigera, כגון קידוד הגנים עבור cadherin30, טרנספורטר קלטות מחייב ATP31,32, כמו גם HaTSPAN133. נוקאאוט של גנים אלה באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 גורם לרמה גבוהה של עמידות לרעלן Bacillus thuringiensis (BT) בזנים רגישים. כמו כן, צ’אנג ואח ‘ (2017) דפק את קולטן פרומון, אשר אימת את תפקידו המשמעותי ברגולציה זמן ההזדווגות19. דיווחים אלה מצביעים על כך ש-CRISPR/Cas9 יכול לשמש ככלי יעיל לחקר תפקוד הגנים במערכות חרקים. עם זאת, הליך מפורט לשינוי CRISPR/Cas9 במערכות החרקים נותר לא שלם, מה שמגביל את טווח היישום שלו בגנומיקה תפקודית של חרקים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפלת גן פונקציונלי ב H. armigera באמצעות מערכת CRISPR / Cas9. פרוטוקול מפורט מפורט שלב אחר שלב מסופק, כולל תכנון והכנה של פריימרים ספציפיים לגן לייצור gRNA, איסוף עוברים, מיקרו-חדירה, גידול חרקים וזיהוי מוטציות. פרוטוקול זה משמש התייחסות בעלת ערך למניפולציה של כל הגנים התפקודיים ב – H. armigera וניתן להרחיבו למינים אחרים של לפידופטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היישום של מערכת CRISPR/Cas9 סיפק תמיכה טכנית רבת עוצמה לניתוח תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים. הפרוטוקול המפורט שאנו מציגים כאן מדגים את הדור של מוטציה הומוזיגוטה ב H. armigera באמצעות עריכת גנום CRISPR / Cas9. הליך אמין זה מספק דרך פשוטה עבור mutagenesis גנים מכוונים ב H. armigera.
ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31725023, 31861133019 ל- GW, 31171912 ל- CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
