Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.
Abstract
Der Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera, ist einer der zerstörerischsten Schädlinge der Welt. Eine Kombination aus Molekulargenetik, Physiologie, funktioneller Genomik und Verhaltensstudien hat H. armigera zu einer Modellart in Lepidoptera Noctuidae gemacht. Um die In-vivo-Funktionen und Interaktionen zwischen verschiedenen Genen zu untersuchen, ist die Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Associated Protein 9 (Cas9) Genom-Editing-Technologie eine bequeme und effektive Methode zur Durchführung funktioneller genomischer Studien. In dieser Studie stellen wir eine schrittweise systematische Methode zur Verfügung, um den Gen-Knockout bei H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System abzuschließen. Das Design und die Synthese der Guide-RNA (gRNA) werden detailliert beschrieben. Anschließend werden die nachfolgenden Schritte, bestehend aus genspezifischem Primer-Design für die Erstellung von Guide-RNA (gRNA), Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantendetektion zusammengefasst. Schließlich werden Ratschläge und Hinweise zur Fehlerbehebung bereitgestellt, um die Effizienz der Genbearbeitung zu verbessern. Unsere Methode wird als Referenz für die Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung bei H. armigera sowie anderen Schmetterlingen dienen.
Introduction
Die Anwendung der Genom-Editing-Technologie bietet ein effizientes Werkzeug, um Ziel-Gen-Mutanten in verschiedenen Arten zu erreichen. Die Entstehung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Associated Protein 9 (Cas9)-Systems bietet eine neuartige Methode zur Manipulation von Genomen1. Das CRISPR/Cas9-System besteht aus einer Guide-RNA (gRNA) und der Cas9-Endonuklease2,3, während die gRNA weiter in zwei Teile unterteilt werden kann, eine zielkomplementäre CRISPR-RNA (crRNA) und eine transaktivierende crRNA (tracrRNA). Die gRNA integriert sich in die Cas9-Endonuklease und bildet ein Ribonukleoprotein (RNP). Mit der gRNA kann die Cas9-Endonuklease über Basenkomplementation auf eine bestimmte Stelle des Genoms gerichtet werden. Die RuvC- und HNH-Domänen des Cas9 spalten die Zielstelle des Genoms drei Basen vor der Pam-Sequenz (Protospacer-Adjacent Motif) und erzeugen einen Doppelstrangbruch (DSB). Die DNA-Spaltung kann dann durch zwei Mechanismen repariert werden, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)4. Die Reparatur des DSB führt Insertionen oder Deletionen ein, um das Zielgen zu inaktivieren, was möglicherweise zu einem vollständigen Verlust der Genfunktion führt. Daher machen die Hierisierbarkeit und Spezifität des CRISPR/Cas9-Systems es zu einer robusten Methode, um Genfunktionen in vivo zu charakterisieren und Geninteraktionen zu analysieren5.
Mit zahlreichen Vorzügen wurde das CRISPR/Cas9-System auf verschiedene Bereiche angewendet, darunter Biomedizin6,7, Gentherapie8,9 und Landwirtschaft10,11,12, und wurde für verschiedene biologische Systeme verwendet, darunter Mikroorganismen13, Pflanzen14,15, Nematoden16 und Säugetiere17 . Bei Wirbellosen wurden viele Insektenarten der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung unterzogen, wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und darüber hinaus18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera ist einer der zerstörerischsten Schädlinge weltweit23 und schädigt zahlreiche Nutzpflanzen, darunter Baumwolle, Sojabohnen und Sorghum24,25. Mit der Entwicklung der Sequenzierungstechnologie wurden das Genom von H. armigera sowie das einer Reihe von Lepidoptera-Insektenarten vollständig sequenziert26,27,28,29. Aus diesen Insekten wurde in den letzten Jahren eine große Anzahl von Resistenz- und Geruchsrezeptorgenen identifiziert und charakterisiert19,27,28,29. Einige resistenzbezogene Gene wurden in H. armigera identifiziert, wie die Gene, die für Cadherin30, einen ATP-bindenden Kassettentransporter31,32, sowie HaTSPAN133 kodieren. Das Ausschalten dieser Gene mittels CRISPR/Cas9-Technologie führt zu einer hohen Resistenz gegen Bacillus thuringiensis (BT)-Toxin in anfälligen Stämmen. Außerdem schalteten Chang et al. (2017) einen Pheromonrezeptor aus, der seine signifikante Funktion bei der Paarungszeitregulation bestätigte19. Diese Berichte deuten darauf hin, dass CRISPR/Cas9 als wirksames Instrument zur Untersuchung der Genfunktion in vivo in Insektensystemen dienen kann. Ein detailliertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Modifikation in Insektensystemen ist jedoch noch unvollständig, was sein Anwendungsspektrum in der funktionellen Genomik von Insekten einschränkt.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein funktionelles Gen in H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System auszuschalten. Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll wird bereitgestellt, einschließlich des Designs und der Vorbereitung von genspezifischen Primern für die gRNA-Produktion, Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantenidentifizierung. Dieses Protokoll dient als wertvolle Referenz zur Manipulation beliebiger funktioneller Gene in H. armigera und kann auf andere Lepidoptera-Arten ausgedehnt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anwendung des CRISPR/Cas9-Systems hat eine leistungsstarke technische Unterstützung für die Analyse der Genfunktion und -interaktion zwischen verschiedenen Genen bereitgestellt. Das detaillierte Protokoll, das wir hier vorstellen, zeigt die Erzeugung einer homozygoten Mutante in H. armigera mittels CRISPR/Cas9 Genome Editing. Dieses zuverlässige Verfahren bietet einen einfachen Weg für die gerichtete Genmutagenese bei H. armigera.
Die Wahl der CRISPR-Zielorte könnte …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 gw und 31171912 cy) unterstützt.
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
