检查斑马鱼肌肉疾病模型中的肌肉再生
Summary
骨骼肌再生是由组织常驻肌肉干细胞驱动的，这些干细胞在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中受损，这导致肌肉无法再生。在这里，我们描述了一个协议，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。
Abstract
骨骼肌在受伤后具有非凡的再生能力，这是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的。受伤后，肌肉干细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。在许多肌肉浪费条件下，包括肌肉萎缩和老化，这个过程是受损的，导致肌肉无法再生。斑马鱼的肌肉再生过程高度保守，哺乳动物系统为研究肌肉干细胞功能和再生提供了一个极好的系统，在肌肉消耗条件下，如肌肉萎缩症。在这里，我们提出了一种方法来检查肌肉再生在斑马鱼模型的肌肉疾病。第一步涉及使用基因分型平台，允许在引起伤害之前确定幼虫的基因型。在确定基因型后，肌肉被针刺受伤，然后用偏振光显微镜确定肌肉再生的程度。因此，我们提供了一个高吞吐量管道，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。
Introduction
骨骼肌占人体质量的30-50%，不仅对运动不可或缺，而且作为关键的代谢和储存器官1。尽管是后体，骨骼肌是高度动态的，并保留巨大的再生能力后受伤。这是由于组织常驻干细胞（也称为卫星细胞）的存在，位于肌瘤的基底拉米纳下，并标有转录因子配对盒蛋白7（pax7）和/或配对盒蛋白3（pax3），等等2，3。受伤后，卫星细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。调节卫星细胞激活和强健肌肉修复的高度保存的亲再生信号级联在各种条件下受到影响，如肌病和静止老化4，5。
一个如此多样化的肌病组是肌肉萎缩症，其特点是渐进性肌肉浪费和退化6。这些疾病是关键蛋白质的基因突变的结果，包括肌营养不良素和层压素-2 （LAMA2），负责将肌肉纤维附着在细胞外基质7，8。鉴于与肌肉营养不良有关的蛋白质在维持肌肉结构方面起着如此核心的作用，多年来人们一直认为，这一过程中的失败是导致疾病发病机制的机制。然而，最近的研究已经发现肌肉干细胞的调节缺陷和随后的肌肉再生损伤是肌肉病理学观察到的第二个可能的基础，在肌肉营养不良症10，11。因此，需要进一步研究肌肉干细胞功能和相关利基元素的损伤如何导致肌肉萎缩。
在过去的十年里，斑马鱼（Danio rerio）已经成为疾病建模12的重要脊椎动物模型。这要归功于斑马鱼胚胎的快速外部发育，以及它的光学清晰度，这允许肌肉形成、生长和功能的直接可视化。此外，斑马鱼不仅高度保存肌肉的发育和结构，还表现出高度保存的肌肉再生过程13。因此，斑马鱼是研究肌肉疾病病理生物学，并探索肌肉再生如何影响它的一个很好的系统。为此，我们开发了一种方法，使肌肉疾病斑马鱼模型的骨骼肌再生能够及时研究。这种高通量管涉及一种方法，基因型活胚胎14，随后进行针刺损伤和肌肉再生的程度图像使用极化光显微镜。因此，该技术的利用将揭示肌肉疾病斑马鱼模型中肌肉的再生能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨骼肌再生是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的，其功能在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中改变，从而阻碍肌肉再生的过程。在这里，我们描述了一个高吞吐量协议，以检查肌肉疾病的活斑马鱼模型的肌肉再生。管道的第一步利用胚胎基因分型平台14，这是一个用户友好和准确的方法来确定活幼虫的基因型，然后再进行下游再生测定。其直接好处是，它允许选择仅感兴趣的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢亚历克斯·富尔彻博士和莫纳什微成像公司为显微镜维护和设置提供帮助。澳大利亚再生医学研究所得到维多利亚州政府和澳大利亚政府的赠款支持。这项工作是由肌肉萎缩协会（美国）项目赠款资助给P.D.C（628882）。
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
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