Undersøgelse muskel regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom
Summary
Skeletmuskulatur regenerering er drevet af væv hjemmehørende muskel stamceller, som er svækket i mange muskelsygdomme såsom muskelsvind, og dette resulterer i manglende evne til muskel til at regenerere. Her beskriver vi en protokol, der gør det muligt at undersøge muskelgendannelse i zebrafiskmodeller af muskelsygdom.
Abstract
Skeletmuskulatur har en bemærkelsesværdig evne til at regenerere efter skade, som er drevet af obligate væv hjemmehørende muskel stamceller. Efter skade aktiveres muskelstamcellert og gennemgår cellespredning for at generere en pulje af myoblaster, som efterfølgende differentierer sig til at danne nye muskelfibre. I mange muskelsvind betingelser, herunder muskelsvind og aldring, denne proces er nedsat resulterer i manglende evne til muskel til at regenerere. Processen med muskel regenerering i zebrafisk er meget bevaret med pattedyr systemer giver et glimrende system til at studere muskel stamcellefunktion og regenerering, i muskelsvind betingelser såsom muskeldystrofi. Her præsenterer vi en metode til at undersøge muskel regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom. Det første trin indebærer brug af en genotypingplatform, der gør det muligt at bestemme larvernes genotype, før der fremkaldes en skade. Efter at have bestemt genotypen kommer musklen til skade ved hjælp af et nålestik, hvorefter polariserende lysmikroskopi bruges til at bestemme omfanget af muskelgendannelse. Vi leverer derfor en høj gennemløbspipeline, der gør det muligt at undersøge muskelgendannelse i zebrafiskmodeller af muskelsygdom.
Introduction
Skeletmuskulatur tegner sig for 30-50% af den menneskelige kropsmasse og er ikke kun uundværlig for bevægelse, men det fungerer også som et kritisk metabolisk og opbevaringsorgan1. På trods af at være postmitotisk, skeletmuskulatur er meget dynamisk og bevarer en enorm regenerativ kapacitet efter skade. Dette tilskrives tilstedeværelsen af væv bosiddende stamceller (også kaldet satellitceller), placeret under basal lamina af myofibers og præget af transskription faktorer parret kasse protein 7 (pax7) og / eller parret kasse protein 3 (pax3), blandt andre2,3. Efter skade aktiveres satellitcellen og gennemgår cellespredning for at generere en pulje af myoblaster, som efterfølgende differentierer sig for at danne nye muskelfibre. Den stærkt bevarede kaskade af pro-regenerative signaler, der regulerer satellitcelleaktivering og robust muskelreparation, påvirkes under forskellige forhold såsom myopatier og homøostatiskaldring 4,5.
En så forskelligartet gruppe af myopatier er muskeldystrofi, karakteriseret ved progressiv muskelsvind og degeneration6. Disse sygdomme er konsekvensen af genetiske mutationer i nøgleproteiner, herunder dystrophin og laminin-α2 (LAMA2), der er ansvarlig for fastgørelse af muskelfibre til den ekstracellulære matrix7,8. I betragtning af at proteiner impliceret i muskeldystrofi spiller en så central rolle i opretholdelsen af muskelstruktur, troede man i mange år, at en fiasko i denne proces var den mekanisme, der var ansvarlig for sygdomspatogenese9. Nylige undersøgelser har imidlertid identificeret defekter i reguleringen af muskelstamceller og efterfølgende svækkelse i muskelgendannelse som et andet muligt grundlag for muskelpatologi observeret i muskeldystrofi10,11. Som sådan er der behov for yderligere undersøgelser for at undersøge, hvordan en svækkelse i muskelstamcellefunktion og tilknyttede nicheelementer bidrager til muskeldystrofi.
I løbet af det seneste årti har zebrafisk (Danio rerio) vist sig som en vigtig hvirveldyr model for sygdom modellering12. Dette tilskrives den hurtige eksterne udvikling af zebrafiskembryoet kombineret med dets optiske klarhed, som muliggør direkte visualisering af muskeldannelse, vækst og funktion. Derudover er ikke kun udviklingen og strukturen af muskler stærkt bevaret i zebrafisk, de viser også en stærkt bevaret proces med muskelgendannelse13. Derfor repræsenterer zebrafisk et fremragende system til at studere patobiologien af muskelsygdomme og undersøge, hvordan muskelgendannelse påvirkes i det. Til dette formål har vi udviklet en metode, der muliggør rettidig undersøgelse af skeletmuskulatur regenerering i zebrafisk modeller af muskelsygdom. Denne høj gennemstrømningsrørledning involverer en metode til genotype levende embryoner14, hvorefter der udføres en nålestikskade, og omfanget af muskelgendannelse afbildes ved hjælp af polariserende lysmikroskopi. Anvendelsen af denne teknik vil derfor afsløre den regenerative kapacitet af muskler i zebrafisk modeller af muskelsygdom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skeletmuskulatur regenerering er drevet af obligate væv hjemmehørende muskel stamceller, hvis funktion er ændret i mange muskelsygdomme såsom muskelsvind, efterfølgende hæmmer processen med muskel regenerering. Her beskriver vi en høj gennemløbsprotokol til at undersøge muskelgendannelse i levende zebrafiskmodeller af muskelsygdom. Det første trin i rørledningen bruger en embryogenotyping platform14, som er en brugervenlig og præcis metode til at bestemme genotypen af levende larver, f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Alex Fulcher, og Monash Micro Imaging for hjælp med mikroskop vedligeholdelse og opsætning. Den australske Regenerative Medicine Institute er støttet af tilskud fra staten regering Victoria og den australske regering. Dette arbejde blev finansieret af en muskelsvind Association (USA) projekt tilskud til P.D.C (628882).
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
References
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise Metabolism and the Molecular Regulation of Skeletal Muscle Adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
- Relaix, F., Rocancourt, D., Mansouri, A., Buckingham, M. A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature. 435 (7044), 948-953 (2005).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Egerman, M. A., et al. GDF11 Increases with Age and Inhibits Skeletal Muscle Regeneration. Cell Metabolism. 22 (1), 164-174 (2015).
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. The Lancet. 359 (9307), 687-695 (2002).
- Emery, A. E. H. . Duchenne muscular dystrophy. , (1993).
- Anne Helbling-Leclerc, P. G. Mutations in the laminin α2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Nature Genetics. (11), 216-218 (1995).
- Campbell, K. P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell. 80 (5), 675-679 (1995).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Lambert, C. J., et al. An automated system for rapid cellular extraction from live zebrafish embryos and larvae: Development and application to genotyping. PloS One. 13 (3), 0193180 (2018).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 423 (4), 785-788 (2012).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Otten, C., et al. Xirp Proteins Mark Injured Skeletal Muscle in Zebrafish. PLOS ONE. 7 (2), 31041 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle. Journal of Visualized Experiments JoVE. (71), e4351 (2013).
- Nguyen, P. D., et al. Muscle Stem Cells Undergo Extensive Clonal Drift during Tissue Growth via Meox1-Mediated Induction of G2 Cell-Cycle Arrest. Cell Stem Cell. 21 (1), 107-119 (2017).
- Ruparelia, A. A., Ratnayake, D., Currie, P. D. Stem cells in skeletal muscle growth and regeneration in amniotes and teleosts: Emerging themes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 9 (2), 365 (2020).
