मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच
Summary
कंकाल मांसपेशी उत्थान ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं, जो मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी जैसे कई मांसपेशियों के रोगों में बिगड़ा हुआ है द्वारा संचालित है, और इस तरह के मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने में असमर्थता में परिणाम है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की परीक्षा की अनुमति देता है।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी में चोट के बाद पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता होती है, जो ऊतक निवासी मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं को बाध्य करने से प्रेरित होती है। चोट के बाद, मांसपेशी स्टेम सेल सक्रिय है और मायोब्लास्ट का एक पूल उत्पन्न करने के लिए सेल प्रसार से गुजरता है, जो बाद में नए मांसपेशी फाइबर बनाने के लिए अंतर करता है। मस्कुलर डिस्ट्रॉफी और वृद्धावस्था सहित कई मांसपेशियों की बर्बादी की स्थिति में, यह प्रक्रिया बिगड़ी है जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने में असमर्थता होती है। जेब्राफिश में मांसपेशियों के उत्थान की प्रक्रिया को मांसपेशियों की डिस्ट्रॉफी जैसी मांसपेशियों की बर्बादी की स्थितियों में मांसपेशियों के स्टेम सेल समारोह और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करने वाले स्तनधारी प्रणालियों के साथ अत्यधिक संरक्षित किया जाता है। यहां, हम मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की जांच करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। पहले चरण में एक जीनोटाइपिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग शामिल है जो चोट को प्राप्त करने से पहले लार्वा के जीनोटाइप के निर्धारण की अनुमति देता है। जीनोटाइप निर्धारित करने के बाद, मांसपेशियों को सुई चाकू का उपयोग करके घायल कर दिया जाता है, जिसके बाद मांसपेशियों के उत्थान की सीमा निर्धारित करने के लिए ध्रुवीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। इसलिए हम एक उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन प्रदान करते हैं जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान की परीक्षा की अनुमति देता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर द्रव्यमान के 30-50% के लिए खातों, और न केवल लोकोमोशन के लिए अपरिहार्य है, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण चयापचय और भंडारण अंग1के रूप में कार्य करता है । पोस्टमिटोटिक होने के बावजूद, कंकाल की मांसपेशी अत्यधिक गतिशील है और चोट के बाद एक जबरदस्त पुनर्योजी क्षमता को बरकरार रखती है। इसका कारण यह है कि मिओफिबर्स के बेसल लैमिना के नीचे स्थित टिश्यू रेजिडेंट स्टेम सेल (जिसे सैटेलाइट सेल भी कहा जाता है) की उपस्थिति और ट्रांसक्रिप्शन कारकों द्वारा चिह्नित बॉक्स प्रोटीन 7 (पैक्स7)और/या जोड़ा गया बॉक्स प्रोटीन 3 (पैक्स3),अन्य2, 3के बीच । चोट के बाद, उपग्रह कोशिका सक्रिय हो जाती है और मायोब्लास्ट का एक पूल उत्पन्न करने के लिए सेल प्रसार से गुजरती है, जो बाद में नई मांसपेशी फाइबर बनाने के लिए अंतर करती है। उपग्रह कोशिका सक्रियण और मजबूत मांसपेशियों की मरम्मत को विनियमित करने वाले प्रो-पुनर्योजी संकेतों का अत्यधिकसंरक्षितझरना विभिन्न स्थितियों में प्रभावित होता है जैसे कि मायोपैथी और होमोस्टेटिक वृद्धावस्था 4,5।
मायोपैथी का ऐसा ही एक विविध समूह मस्कुलर डिस्ट्रॉफी है, जो प्रगतिशील मांसपेशी बर्बाद करने और6पतन की विशेषता है। ये बीमारियां प्रमुख प्रोटीन में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का परिणाम हैं, जिनमें डिस्ट्रोफिन और लैमिनिन-α2 (लामा2) शामिल हैं, जो बाहीय फाइबर के बाहरी लगाव के लिए जिम्मेदारहैं,जो बाहीय मैट्रिक्स7,8। यह देखते हुए कि मस्कुलर डिस्ट्रॉफी में फंसा प्रोटीन मांसपेशियों की संरचना को बनाए रखने में इस तरह की केंद्रीय भूमिका निभाता है, कई वर्षों तक यह माना जाता था कि इस प्रक्रिया में विफलता रोग रोगजनन9के लिए जिम्मेदार तंत्र था। तथापि, हाल के अध्ययनों में मांसपेशियों की स्टेम कोशिकाओं के नियमन में दोषों और मांसपेशियों के उत्थान में बाद में हानि की पहचान की गई है , जो मांसपेशियों की विकृति10,11में देखी गई मांसपेशियों की विकृति के लिए दूसरे संभावित आधार के रूप में है । जैसे, आगे के अध्ययन की जांच करने के लिए कैसे मांसपेशियों स्टेम सेल समारोह और जुड़े आला तत्वों में एक हानि मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी के लिए योगदान देता है की जरूरत है ।
पिछले एक दशक में, जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)रोग मॉडलिंग12के लिए एक महत्वपूर्ण कशेरुकी मॉडल के रूप में उभरा है । यह जेब्राफिश भ्रूण के तेजी से बाहरी विकास के लिए जिम्मेदार है, इसकी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ मिलकर, जो मांसपेशियों के गठन, विकास और कार्य के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, न केवल जेब्राफिश में अत्यधिक संरक्षित मांसपेशियों का विकास और संरचना है, वे मांसपेशियों के उत्थान की एक अत्यधिक संरक्षित प्रक्रिया भी प्रदर्शित करते हैं13। नतीजतन, जेब्राफिश मांसपेशियों की बीमारियों के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं, और यह पता लगाते हैं कि मांसपेशियों के उत्थान में कैसे प्रभावित होता है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक विधि विकसित की है जो मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में कंकाल मांसपेशी उत्थान के समय पर अध्ययन करने में सक्षम बनाती है। इस उच्च थ्रूपुट पाइपलाइन में जीवित भ्रूण14जीनोटाइप के लिए एक विधि शामिल है, जिसके बाद सुई-चाकू की चोट की जाती है और मांसपेशियों के उत्थान की सीमा को ध्रुवीकरण प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाता है। इसलिए इस तकनीक के उपयोग से मांसपेशियों की बीमारी के जेब्राफिश मॉडल में मांसपेशियों की पुनर्योजी क्षमता का पता चल जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
कंकाल मांसपेशी उत्थान अनिवार्य ऊतक निवासी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं, जिसका समारोह मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी जैसे कई मांसपेशियों के रोगों में बदल जाता है, बाद में मांसपेशियों के उत्थान की प्रक्रिया में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माइक्रोस्कोप रखरखाव और सेटअप के साथ सहायता के लिए डॉ एलेक्स फुलचर, और मोनाश माइक्रो इमेजिंग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । ऑस्ट्रेलियाई पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान विक्टोरिया राज्य सरकार और ऑस्ट्रेलियाई सरकार से अनुदान द्वारा समर्थित है । इस काम को पी.डी..C (628882) को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (यूएसए) परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 24 well plates | Thermo Fischer | 142475 | |
| 30 gauge needles | Terumo | NN-3013R | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S9014S20 | |
| DNA extraction chips | wFluidx | ZEG chips | |
| Embryo genotyping platform | wFluidx | ZEG base unit | Zebrafish Embryo Genotyper |
| Glass pipette | Hirschmann | 9260101 | |
| Glass plate dish | WPI | FD35-100 | Commonly referred to as FluoroDish |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic pipette | Livingstone | PTP03-01 | |
| Polarizing microscope | Abrio | N/A |
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