Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal
Summary
Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.
Abstract
No passado, os sistemas de modelo epitelial intestinal limitavam-se a linhas celulares transformadas e tecido primário. Esses sistemas de modelos têm limitações inerentes, pois os primeiros não representam fielmente a fisiologia do tecido original, e a disponibilidade deste último é limitada. Assim, sua aplicação dificulta pesquisas fundamentais e de desenvolvimento de medicamentos. Organoides adultos à base de células-tronco (a partir de agora referidos como organoides) são miniaturas de tecido epitelial normal ou doente do qual são derivados. Eles podem ser estabelecidos de forma muito eficiente a partir de diferentes regiões gastrointestinais (GI), têm expansão a longo prazo e simulam respostas específicas de tecidos e pacientes para tratamentos in vitro. Aqui, o estabelecimento de monocamadas epiteliais derivadas de organoides intestinais tem sido demonstrado juntamente com métodos para medir a integridade da barreira epitelial, permeabilidade e transporte, secreção de proteína antimicrobiana, bem como histologia. Além disso, as monocamadas derivadas de organoides intestinais podem ser enriquecidas com células de tronco e amplificadores de trânsito, bem como com células epiteliais diferenciadas. Portanto, eles representam um sistema modelo que pode ser adaptado para estudar os efeitos dos compostos nas células alvo e seu modo de ação. Embora as culturas organoides sejam tecnicamente mais exigentes do que as linhas celulares, uma vez estabelecidas, elas podem reduzir falhas nos estágios posteriores do desenvolvimento de medicamentos, pois representam verdadeiramente a complexidade do epitélio vivo e a heterogeneidade interpatente.
Introduction
O epitélio intestinal age como uma barreira física entre o conteúdo luminal dos intestinos e o tecido subjacente. Esta barreira compreende uma única camada epitelial de enterócitos principalmente absortivos que são conectados por junções apertadas, que estabelecem fortes conexões intercelulares entre células adjacentes. Essas células formam um revestimento epitelial polarizado que separa os lados apical (lúmen) e basolateral do intestino, ao mesmo tempo em que regulam o transporte paracelular de nutrientes e metabólitos digeridos. Além dos enterócitos, outras células epiteliais importantes, como cálice, paneto e células enteroendócrinas também contribuem para a homeostase intestinal produzindo muco, peptídeos antimicrobianos e hormônios, respectivamente. O epitélio intestinal é constantemente reabastecido dividindo células-tronco de receptor 5-positivo (LGR5+) na parte inferior das criptas intestinais que produzem células amplificadoras de trânsito (TA) que migram para cima e se diferenciam em outros tipos de células1. A interrupção da homeostase epitelial intestinal por fatores genéticos e ambientais, como exposição a alérgenos alimentares, compostos medicinais e patógenos microbianos, leva à interrupção da função da barreira intestinal. Essas condições causam várias doenças intestinais, incluindo doença inflamatória intestinal (DII), doença celíaca e toxicidade gi induzida por drogas2.
Estudos sobre o epitélio intestinal são realizados usando vários sistemas de plataforma in vitro, como inserções de membrana, sistemas de órgãos em um chip, câmaras de Ussing e anéis intestinais. Essas plataformas são adequadas para estabelecer monocamadas epiteliais polarizadas com acesso a lados apical e basolateral da membrana, utilizando linhas celulares transformadas ou tecido primário como modelos. Embora as linhas celulares transformadas, como as linhas celulares colorretal (adeno)carcinoma Caco-2, T84 e HT-29, sejam capazes de se diferenciar em enterócitos intestinais polarizados ou células produtoras de muco até certo ponto, elas não são representativas do epitélio in vivo, pois vários tipos de células estão faltando, e vários receptores e transportadores são expressosarantberly 3 . Além disso, como as linhas celulares são derivadas de um único doador, elas não representam heterogeneidade interpata e sofrem de menor complexidade e relevância fisiológica. Embora os tecidos primários usados nas câmaras de Ussing e como anéis intestinais sejam mais representativos da situação in vivo, sua disponibilidade limitada, viabilidade a curto prazo e falta de expansão os tornam inadequados como um meio para estudos de alta produtividade (HT).
Organoides são culturas epiteliais in vitro estabelecidas a partir de diferentes órgãos, como intestino, rim, fígado, pâncreas e pulmão. Comprovadamente, possuem expansão estável e de longo prazo, bem como estabilidade genética e fenotípica e, portanto, são miniaturas biológicas representativas do epitélio do órgão original com respostas fiéis a estímulos externos 4,5,6,7,8,9. Os organoides são eficientemente estabelecidos a partir de tecido normal, doente, inflamado ou cancerígeno, representando respostas heterogêneas específicas do paciente 10,11,12,13,14,15,16. Este artigo demonstra como estabelecer monocamadas epiteliais intestinais derivadas de culturas organoides. Monocamadas foram estabelecidas com sucesso a partir de pequenas culturas intestinais, bem como culturas organoides coloniais e retal. Este modelo cria uma oportunidade de estudar o transporte e a permeabilidade das células epiteliais para drogas, bem como seus efeitos toxicológicos sobre o epitélio. Além disso, o modelo permite que a cocultura com células imunes e bactérias estude suas interações com o epitélio intestinal 17,18,19. Além disso, esse modelo pode ser usado para estudar respostas a terapias de forma específica do paciente e iniciar esforços de triagem para procurar a próxima onda de terapêuticas focadas em barreiras epiteliais. Tal abordagem poderia ser estendida à clínica e abrir caminho para tratamentos personalizados.
Embora as monocamadas epiteliais neste protocolo sejam preparadas a partir de organoides intestinais normais humanos, o protocolo pode ser aplicado e otimizado para outros modelos organoides. As monocamadas organoides epitelial são cultivadas em meio de expansão organoide intestinal contendo Wnt para apoiar a proliferação de células-tronco e representar a composição celular criptoina intestinal. Organoides intestinais podem ser enriquecidos para ter diferentes destinos epiteliais intestinais, como enterócitos, panéstas, cálices e células enteroendócrinas, modulando vias Wnt, Notch e fator de crescimento epidérmico (EGF). Aqui, após o estabelecimento de monocamadas em meio de expansão, elas são conduzidas para células epiteliais intestinais mais diferenciadas, como descrito anteriormente 20,21,22,23,24,25. Para fins de triagem, dependendo do modo de ação do composto de interesse, suas células-alvo e as condições experimentais, as monocamadas podem ser conduzidas em direção à composição celular de escolha para medir os efeitos do composto com leituras funcionais relevantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a manipulação geral e manutenção de organoides intestinais, bem como a preparação e possíveis aplicações de monocamadas epiteliais derivadas desses organoides. Até o momento, as monocamadas foram preparadas com sucesso a partir do duodeno, íleo e diferentes regiões de organoides de cólon derivados do tecido intestinal normal, bem como anteriormente e ativamente inflamado (dados inéditos). A aplicação de monocamadas organoides derivadas do paciente facilita o estudo da função de b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) subsídio de parcerias público-privadas (PPP) do setor holandês LSH com o número do Projeto LSHM16021 Organoids como nova ferramenta para modelagem toxicológica para a Tecnologia Organoide Hubrecht (HUB) e financiamento interno hub para modelagem de doenças e departamento de toxicologia. Agradecemos aos laboratórios da Sabine Middendorp (Divisão de Gastroenterologia Pediátrica, Hospital Infantil Wilhelmina, UMC, Utrecht) e Hugo R. de Jonge e Marcel J.C. Bijvelds (Departamento de Gastroenterologia e Hepatologia, Erasmus MC, Roterdã) por fornecerem suporte técnico inicial para a configuração de monocamadas em pastilhas de membrana.
Materials
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
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