Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion
Summary
Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.
Abstract
In der Vergangenheit waren intestinale Epithelmodellsysteme auf transformierte Zelllinien und Primärgewebe beschränkt. Diese Modellsysteme haben inhärente Einschränkungen, da erstere die ursprüngliche Gewebephysiologie nicht getreu darstellen und die Verfügbarkeit der letzteren begrenzt ist. Daher behindert ihre Anwendung die Grundlagen- und Arzneimittelentwicklungsforschung. Adulte Stammzell-basierte Organoide (im Folgenden als Organoide bezeichnet) sind Miniaturen von normalem oder erkranktem Epithelgewebe, aus dem sie gewonnen werden. Sie können sehr effizient aus verschiedenen gastrointestinalen (GI) Traktregionen etabliert werden, haben eine langfristige Erweiterbarkeit und simulieren gewebe- und patientenspezifische Reaktionen auf Behandlungen in vitro. Hier wurde die Etablierung von intestinalen organoidabgeleiteten epithelialen Monoschichten zusammen mit Methoden zur Messung der Integrität, Permeabilität und des Transports der Epithelbarriere, der antimikrobiellen Proteinsekretion sowie der Histologie demonstriert. Darüber hinaus können intestinale Organoid-abgeleitete Monoschichten mit proliferierenden Stamm- und Transit-amplifizierenden Zellen sowie mit wichtigen differenzierten Epithelzellen angereichert werden. Daher stellen sie ein Modellsystem dar, das darauf zugeschnitten werden kann, die Auswirkungen von Verbindungen auf Zielzellen und deren Wirkungsweise zu untersuchen. Obwohl Organoidkulturen technisch anspruchsvoller sind als Zelllinien, können sie, sobald sie sich etabliert haben, Fehler in den späteren Stadien der Arzneimittelentwicklung reduzieren, da sie wirklich die Komplexität des In-vivo-Epithels und die interpatientische Heterogenität darstellen.
Introduction
Das Darmepithel fungiert als physikalische Barriere zwischen dem luminalen Gehalt des Darms und dem darunter liegenden Gewebe. Diese Barriere besteht aus einer einzigen Epithelschicht von hauptsächlich absorbierenden Enterozyten, die durch Tight Junctions verbunden sind, die starke interzelluläre Verbindungen zwischen benachbarten Zellen herstellen. Diese Zellen bilden eine polarisierte Epithelauskleidung, die die apikale (Lumen) und die basolaterale Seite des Darms trennt und gleichzeitig den parazellulären Transport von verdauten Nährstoffen und Metaboliten reguliert. Neben den Enterozyten tragen auch andere wichtige Epithelzellen wie Kelch-, Paneth- und enteroendokrine Zellen zur intestinalen Homöostase bei, indem sie Schleim, antimikrobielle Peptide bzw. Hormone produzieren. Das Darmepithel wird ständig durch die Teilung von Leucin-reichen wiederholungshaltigen G-Protein-gekoppelten Rezeptor-5-positiven (LGR5+) Stammzellen im Boden von Darmkrypten aufgefüllt, die transit-amplifizierende (TA) Zellen produzieren, die nach oben wandern und sich in andere Zelltypendifferenzieren 1. Eine Störung der intestinalen Epithelhomöostase durch genetische und Umweltfaktoren wie die Exposition gegenüber Nahrungsmittelallergenen, medizinischen Verbindungen und mikrobiellen Krankheitserregern führt zu einer Störung der Darmbarrierefunktion. Diese Bedingungen verursachen mehrere Darmerkrankungen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD), Zöliakie und medikamenteninduzierter GI-Toxizität2.
Studien am Darmepithel werden mit verschiedenen In-vitro-Plattformsystemen wie Membraneinsätzen, Organ-on-a-Chip-Systemen, Ussing-Kammern und Darmringen durchgeführt. Diese Plattformen eignen sich für die Etablierung polarisierter epithelialer Monoschichten mit Zugang zu apikalen und basolateralen Seiten der Membran, wobei transformierte Zelllinien oder Primärgewebe als Modelle verwendet werden. Obwohl transformierte Zelllinien, wie die kolorektalen (Adeno-)Karzinom-Zelllinien Caco-2, T84 und HT-29, in der Lage sind, sich bis zu einem gewissen Grad in polarisierte Darmenterozyten oder schleimproduzierende Zellen zu differenzieren, sind sie nicht repräsentativ für das In-vivo-Epithel, da mehrere Zelltypen fehlen und verschiedene Rezeptoren und Transporter abweichend exprimiertwerden 3 . Da Zelllinien von einem einzelnen Spender abgeleitet werden, stellen sie zudem keine interstationäre Heterogenität dar und leiden unter reduzierter Komplexität und physiologischer Relevanz. Obwohl primäre Gewebe, die in Ussing-Kammern und als Darmringe verwendet werden, repräsentativer für die In-vivo-Situation sind, machen ihre begrenzte Verfügbarkeit, kurzfristige Lebensfähigkeit und mangelnde Erweiterbarkeit sie als Medium für Hochdurchsatzstudien (HT) ungeeignet.
Organoide sind in vitro Epithelkulturen, die aus verschiedenen Organen wie Darm, Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse und Lunge hergestellt werden. Sie weisen nachweislich eine langfristige, stabile Erweiterbarkeit sowie genetische und phänotypische Stabilität auf und sind daher repräsentative biologische Miniaturen des Epithels des ursprünglichen Organs mit treuen Reaktionen auf äußere Reize 4,5,6,7,8,9. Organoide werden effizient aus entweder reseziertem oder biopsiertem normalem, erkranktem, entzündetem oder krebsartigem Gewebe hergestellt, das heterogene patientenspezifische Reaktionen 10,11,12,13,14,15,16 darstellt. Diese Arbeit zeigt, wie man intestinale Epithelmonoschichten etabliert, die von organoiden Kulturen abgeleitet sind. Monolayer wurden erfolgreich aus Dünndarm-, Kolon- und Rektalorganoidkulturen etabliert. Dieses Modell schafft die Möglichkeit, den Transport und die Permeabilität der Epithelzellen für Medikamente sowie ihre toxikologischen Wirkungen auf das Epithel zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht das Modell der Kokultur mit Immunzellen und Bakterien, ihre Wechselwirkungen mit dem Darmepithel17,18,19 zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um das Ansprechen auf Therapien patientenspezifisch zu untersuchen und Screening-Bemühungen einzuleiten, um nach der nächsten Welle von epithelialen Barriere-fokussierten Therapeutika zu suchen. Ein solcher Ansatz könnte auf die Klinik ausgeweitet werden und den Weg zu personalisierten Behandlungen ebnen.
Obwohl die epithelialen Monoschichten in diesem Protokoll aus normalen Darmorganoiden des Menschen hergestellt werden, kann das Protokoll für andere Organoidmodelle angewendet und optimiert werden. Epithel-Organoid-Monoschichten werden in intestinalem Organoid-Expansionsmedium, das Wnt enthält, kultiviert, um die Stammzellproliferation zu unterstützen und die zelluläre Zusammensetzung der Darmkrypta darzustellen. Darmorganoide können angereichert werden, um verschiedene intestinale Epithelschicksale wie Enterozyten, Paneth-, Kelch- und enteroendokrine Zellen zu haben, indem Wnt-, Notch- und epidermale Wachstumsfaktor (EGF) -Signalwege moduliert werden. Hier werden sie nach der Etablierung von Monoschichten im Expansionsmedium zu differenzierteren Darmepithelzellen getrieben, wie zuvor beschrieben 20,21,22,23,24,25. Für Screening-Zwecke können die Monoschichten abhängig von der Wirkungsweise der interessierenden Verbindung, ihren Zielzellen und den experimentellen Bedingungen in Richtung der Zellzusammensetzung der Wahl getrieben werden, um die Auswirkungen der Verbindung mit relevanten funktionellen Messwerten zu messen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Manipulation und Aufrechterhaltung von Darmorganoiden sowie die Herstellung und mögliche Anwendungen von epithelialen Monoschichten, die von diesen Organoiden abgeleitet sind. Bisher wurden Monoschichten erfolgreich aus dem Zwölffingerdarm, dem Ileum und verschiedenen Regionen von Dickdarmorganoiden hergestellt, die sowohl aus normalem als auch zuvor und aktiv entzündetem Darmgewebe stammen (unveröffentlichte Daten). Die Anwendung von patientenabgeleiteten organoiden Monosch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt durch das Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) Public-Private Partnerships (PPP) Allowance des niederländischen LSH-Sektors mit der Projektnummer LSHM16021 Organoids als neuartiges Werkzeug für die toxikologische Modellierung der Hubrecht Organoid Technology (HUB) und der HUB-internen Finanzierung für die Abteilung Disease Modeling and Toxicology. Wir danken den Labors von Sabine Middendorp (Abteilung für Pädiatrische Gastroenterologie, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) und Hugo R. de Jonge und Marcel J.C. Bijvelds (Abteilung für Gastroenterologie und Hepatologie, Erasmus MC, Rotterdam) für die erste technische Unterstützung beim Aufbau von Monoschichten auf Membraneinsätzen.
Materials
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
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