Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale
Summary
Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.
Abstract
Dans le passé, les systèmes modèles épithéliaux intestinaux étaient limités aux lignées cellulaires transformées et aux tissus primaires. Ces systèmes modèles ont des limites inhérentes car les premiers ne représentent pas fidèlement la physiologie tissulaire originale et la disponibilité de la seconde est limitée. Par conséquent, leur application entrave la recherche fondamentale et la recherche sur le développement de médicaments. Les organoïdes à base de cellules souches adultes (ci-après appelés organoïdes) sont des miniatures de tissu épithélial normal ou malade dont ils sont dérivés. Ils peuvent être établis très efficacement à partir de différentes régions du tractus gastro-intestinal (GI), ont une extensibilité à long terme et simulent des réponses spécifiques aux tissus et aux patients aux traitements in vitro. Ici, l’établissement de monocouches épithéliales dérivées d’organoïdes intestinaux a été démontré ainsi que des méthodes pour mesurer l’intégrité de la barrière épithéliale, la perméabilité et le transport, la sécrétion de protéines antimicrobiennes, ainsi que l’histologie. De plus, les monocouches dérivées d’organoïdes intestinaux peuvent être enrichies de cellules souches proliférantes et de cellules amplifiant le transit, ainsi que de cellules épithéliales différenciées clés. Par conséquent, ils représentent un système modèle qui peut être adapté pour étudier les effets des composés sur les cellules cibles et leur mode d’action. Bien que les cultures organoïdes soient techniquement plus exigeantes que les lignées cellulaires, une fois établies, elles peuvent réduire les défaillances dans les derniers stades du développement de médicaments car elles représentent vraiment la complexité in vivo de l’épithélium et l’hétérogénéité interpatiente.
Introduction
L’épithélium intestinal agit comme une barrière physique entre le contenu luminal des intestins et le tissu sous-jacent. Cette barrière comprend une seule couche épithéliale d’entérocytes principalement absorbants qui sont reliés par des jonctions serrées, qui établissent de fortes connexions intercellulaires entre les cellules adjacentes. Ces cellules forment une muqueuse épithéliale polarisée qui sépare les côtés apical (lumen) et basolatéral de l’intestin, tout en régulant simultanément le transport paracellulaire des nutriments et des métabolites digérés. En plus des entérocytes, d’autres cellules épithéliales importantes telles que le gobelet, le Paneth et les cellules entéroendocrines contribuent également à l’homéostasie intestinale en produisant du mucus, des peptides antimicrobiens et des hormones, respectivement. L’épithélium intestinal est constamment reconstitué en divisant les cellules souches du récepteur 5 positif (LGR5+) couplées à la protéine G riches en leucine et contenant des protéines G dans le fond des cryptes intestinales produisant des cellules amplifiant le transit (TA) qui migrent vers le haut et se différencient en d’autres types de cellules1. La perturbation de l’homéostasie épithéliale intestinale par des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’exposition à des allergènes alimentaires, des composés médicinaux et des agents pathogènes microbiens, entraîne une perturbation de la fonction de barrière intestinale. Ces affections causent plusieurs maladies intestinales, y compris les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), la maladie cœliaque et la toxicité gastro-intestinale induite par les médicaments2.
Les études sur l’épithélium intestinal sont réalisées à l’aide de plusieurs systèmes de plate-forme in vitro tels que des inserts membranaires, des systèmes d’organes sur puce, des chambres d’Ussing et des anneaux intestinaux. Ces plates-formes conviennent à l’établissement de monocouches épithéliales polarisées avec accès aux côtés apical et basolatéral de la membrane, en utilisant des lignées cellulaires transformées ou des tissus primaires comme modèles. Bien que les lignées cellulaires transformées, telles que les lignées cellulaires colorectales (adéno)carcinomes Caco-2, T84 et HT-29, soient capables de se différencier en entérocytes intestinaux polarisés ou en cellules productrices de mucus dans une certaine mesure, elles ne sont pas représentatives de l’épithélium in vivo car plusieurs types de cellules sont manquants et divers récepteurs et transporteurs sont exprimés de manière aberrante3 . De plus, comme les lignées cellulaires sont dérivées d’un seul donneur, elles ne représentent pas l’hétérogénéité interpatiente et souffrent d’une complexité et d’une pertinence physiologique réduites. Bien que les tissus primaires utilisés dans les chambres d’Ussing et comme anneaux intestinaux soient plus représentatifs de la situation in vivo, leur disponibilité limitée, leur viabilité à court terme et leur manque d’extensibilité les rendent impropres comme milieu pour les études à haut débit (HT).
Les organoïdes sont des cultures épithéliales in vitro établies à partir de différents organes tels que l’intestin, les reins, le foie, le pancréas et les poumons. Il est prouvé qu’ils ont une extensibilité stable à long terme ainsi qu’une stabilité génétique et phénotypique et sont donc des miniatures biologiques représentatives de l’épithélium de l’organe d’origine avec des réponses fidèles aux stimuli externes 4,5,6,7,8,9. Les organoïdes sont efficacement établis à partir de tissus normaux, malades, enflammés ou cancéreux réséqués ou biopsiés, représentant des réponses hétérogènes spécifiques au patient10,11,12,13,14,15,16. Cet article montre comment établir des monocouches épithéliales intestinales dérivées de cultures organoïdes. Des monocouches ont été établies avec succès à partir de cultures organoïdes de l’intestin grêle, du côlon et du rectum. Ce modèle crée une opportunité d’étudier le transport et la perméabilité des cellules épithéliales aux médicaments ainsi que leurs effets toxicologiques sur l’épithélium. De plus, le modèle permet la co-culture avec des cellules immunitaires et des bactéries pour étudier leurs interactions avec l’épithélium intestinal 17,18,19. En outre, ce modèle peut être utilisé pour étudier les réponses aux thérapies d’une manière spécifique au patient et initier des efforts de dépistage pour rechercher la prochaine vague de thérapies axées sur la barrière épithéliale. Une telle approche pourrait être étendue à la clinique et ouvrir la voie à des traitements personnalisés.
Bien que les monocouches épithéliales de ce protocole soient préparées à partir d’organoïdes intestinaux normaux humains, le protocole peut être appliqué et optimisé pour d’autres modèles organoïdes. Les monocouches organoïdes épithéliales sont cultivées dans un milieu d’expansion organoïde intestinal contenant Wnt pour soutenir la prolifération des cellules souches et représenter la composition cellulaire de la crypte intestinale. Les organoïdes intestinaux peuvent être enrichis pour avoir différents destins épithéliaux intestinaux, tels que les entérocytes, Paneth, gobelet et cellules entéroendocrines, en modulant les voies Wnt, Notch et du facteur de croissance épidermique (EGF). Ici, après l’établissement de monocouches en milieu d’expansion, elles sont entraînées vers des cellules épithéliales intestinales plus différenciées, comme décrit précédemment 20,21,22,23,24,25. À des fins de criblage, en fonction du mode d’action du composé d’intérêt, de ses cellules cibles et des conditions expérimentales, les monocouches peuvent être dirigées vers la composition cellulaire de choix pour mesurer les effets du composé avec des lectures fonctionnelles pertinentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la manipulation générale et le maintien des organoïdes intestinaux ainsi que la préparation et les applications possibles de monocouches épithéliales dérivées de ces organoïdes. À ce jour, des monocouches ont été préparées avec succès à partir du duodénum, de l’iléon et de différentes régions d’organoïdes du côlon dérivés de tissus intestinaux normaux ainsi que précédemment et activement enflammés (données non publiées). L’application de monocouches organoïdes dér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le Topsector Life Sciences & Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) allocation de partenariats public-privé (PPP) du secteur néerlandais LSH avec le numéro de projet LSHM16021 Organoïdes comme nouvel outil de modélisation toxicologique à Hubrecht Organoid Technology (HUB) et HUB financement interne au département de modélisation des maladies et de toxicologie. Nous remercions les laboratoires de Sabine Middendorp (Division de gastroentérologie pédiatrique, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) et Hugo R. de Jonge et Marcel J.C. Bijvelds (Département de gastroentérologie et d’hépatologie, Erasmus MC, Rotterdam) d’avoir fourni un soutien technique initial pour la mise en place de monocouches sur inserts membranaires.
Materials
| 100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| 15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
| 24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
| 24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
| 40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| 50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
| 96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
| 96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| 96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
| 96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
| 96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| CO2 incubator | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Glass pipettes | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
| Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
| Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
| Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
| Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
| Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
| Plate shaker | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
| Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
| Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
| Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
| Water bath | Grant | ||
| Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
References
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