Her beskriver vi utarbeidelsen av humane organoid-avledede intestinale epitelmonolayers for å studere tarmbarrierefunksjon, permeabilitet og transport. Ettersom organoider representerer original epitelvevsrespons på ytre stimuli, kombinerer disse modellene fordelene ved utvidelse av cellelinjer og relevansen og kompleksiteten til primærvevet.
Tidligere var intestinale epitelmodellsystemer begrenset til transformerte cellelinjer og primærvev. Disse modellsystemene har iboende begrensninger da førstnevnte ikke trofast representerer original vevsfysiologi, og tilgjengeligheten av sistnevnte er begrenset. Derfor hemmer søknaden deres grunnleggende forskning og forskning på narkotikautvikling. Voksne stamcellebaserte organoider (heretter kalt organoider) er miniatyrer av normalt eller sykt epitelvev som de er avledet fra. De kan etableres svært effektivt fra forskjellige gastrointestinale (GI) traktatregioner, har langsiktig utvidbarhet og simulerer vevs- og pasientspesifikke responser på behandlinger in vitro. Her har etableringen av intestinal organoid-avledede epitelale monolayers blitt demonstrert sammen med metoder for å måle epitelial barriereintegritet, permeabilitet og transport, antimikrobiell proteinsekresjon, samt histologi. Videre kan intestinale organoid-avledede monolayers berikes med prolifererende stamme- og transittforsterkende celler samt med viktige differensierte epitelceller. Derfor representerer de et modellsystem som kan skreddersys for å studere effekten av forbindelser på målceller og deres virkningsmåte. Selv om organoidkulturer er teknisk mer krevende enn cellelinjer, kan de når de først er etablert, redusere feil i de senere stadiene av narkotikautvikling, da de virkelig representerer in vivo epitelkompleksitet og interpatient heterogenitet.
Tarmepitelet virker som en fysisk barriere mellom tarmens lysende innhold og det underliggende vevet. Denne barrieren består av et enkelt epitellag av hovedsakelig absorptive enterocytter som er forbundet med tette veikryss, som etablerer sterke intercellulære forbindelser mellom tilstøtende celler. Disse cellene danner en polarisert epitelforing som skiller de apikale (lumen) og basolaterale sidene av tarmen, samtidig som paracellulær transport av fordøyde næringsstoffer og metabolitter reguleres samtidig. I tillegg til enterocytter bidrar andre viktige epitelceller som beger, Paneth og enterokendokrine celler også til intestinal homeostase ved å produsere henholdsvis slim, antimikrobielle peptider og hormoner. Tarmepitelet etterfylles kontinuerlig ved å dele leucinrike repeterende G-protein-koblede reseptor 5-positive (LGR5+) stamceller i bunnen av tarmkrypter som produserer transittforsterkende (TA) celler som migrerer oppover og skiller seg ut i andre celletyper1. Forstyrrelse av intestinal epitelial homeostase ved genetiske og miljømessige faktorer, for eksempel eksponering for matallergener, medisinske forbindelser og mikrobielle patogener, fører til forstyrrelse av tarmbarrierefunksjonen. Disse tilstandene forårsaker flere tarmsykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD), cøliaki og legemiddelindusert GI-toksisitet2.
Studier på tarmepitelet utføres ved hjelp av flere in vitro-plattformsystemer som membraninnlegg, organer-på-en-chip-systemer, Ussing-kamre og tarmringer. Disse plattformene er egnet for å etablere polariserte epitel monolayers med tilgang til både apikale og basolaterale sider av membranen, ved hjelp av transformerte cellelinjer eller primærvev som modeller. Selv om transformerte cellelinjer, som de kolorektale (adeno)karsinomcellelinjene Caco-2, T84 og HT-29, er i stand til å skille seg ut i polariserte tarm enterocytter eller slimproduserende celler til en viss grad, er de ikke representative for in vivo epitelet ettersom flere celletyper mangler, og ulike reseptorer og transportører er avvikende uttrykt3 . I tillegg, ettersom cellelinjer er avledet fra en enkelt donor, representerer de ikke interpatient heterogenitet og lider av redusert kompleksitet og fysiologisk relevans. Selv om primærvev som brukes i ussingkamre og som tarmringer er mer representative for in vivo-situasjonen, gjør deres begrensede tilgjengelighet, kortsiktig levedyktighet og mangel på utvidelsesevne dem uegnet som et medium for HT-studier (high-throughput).
Organoider er in vitro epitelkulturer etablert fra forskjellige organer som tarm, nyre, lever, bukspyttkjertel og lunge. De har vist seg å ha langsiktig, stabil utvidbarhet samt genetisk og fenotypisk stabilitet og er derfor representative biologiske miniatyrer av epitelet i det opprinnelige organet med trofaste svar på ytre stimuli 4,5,6,7,8,9. Organoider er effektivt etablert fra enten resected eller biopsied normal, syk, betent eller kreftvev, som representerer heterogene pasientspesifikke responser 10,11,12,13,14,15,16. Dette papiret demonstrerer hvordan man etablerer intestinale epitelmonolayer avledet fra organoidkulturer. Monolayers har blitt vellykket etablert fra små tarm samt koloniske og rektal organoid kulturer. Denne modellen skaper en mulighet til å studere transport og permeabilitet av epitelceller til narkotika samt deres toksikologiske effekter på epitelet. Videre tillater modellen samkultur med immunceller og bakterier å studere deres interaksjoner med tarmepitelet 17,18,19. Videre kan denne modellen brukes til å studere svar på terapier på en pasientspesifikk måte og initiere screeninginnsats for å se etter neste bølge av epitelbaserte barrierefokuserte terapeutiske behandlinger. En slik tilnærming kan utvides til klinikken og bane vei for personlige behandlinger.
Selv om epitel monolayers i denne protokollen er fremstilt fra humane normale intestinale organoider, kan protokollen brukes og optimaliseres for andre organoidmodeller. Epitelial organoid monolayers dyrkes i intestinal organoid ekspansjonsmedium som inneholder Wnt for å støtte stamcelleproliferasjon og representere intestinal kryptcellulær sammensetning. Intestinale organoider kan berikes for å ha forskjellige intestinale epiteliske skjebner, for eksempel enterocytter, Paneth, beger og enteroendokrine celler, ved å modulere Wnt, Notch og epidermal vekstfaktor (EGF) veier. Her, etter etableringen av monolayers i ekspansjonsmedium, drives de mot mer differensierte tarmepiteleceller, som beskrevet tidligere 20,21,22,23,24,25. For screeningformål, avhengig av virkningsmåten til forbindelsen av interesse, målcellene og de eksperimentelle forholdene, kan monolayers drives mot den valgte cellesammensetningen for å måle effekten av forbindelsen med relevante funksjonelle avlesninger.
Denne protokollen beskriver generell manipulering og vedlikehold av intestinale organoider samt fremstilling og mulige anvendelser av epitelmonolayer avledet fra disse organoidene. Til dags dato har monolayers blitt vellykket forberedt fra tolvfingertarmen, ileum og forskjellige regioner av kolonorganoider avledet fra normal så vel som tidligere og aktivt betent tarmvev (upubliserte data). Anvendelsen av pasientavledede organoidmonolayers letter studiet av barrierefunksjon på en sykdoms- og pasientspesifikk måte, samt…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av Topsector Life Sciences &Health – Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) offentlig-private partnerskap (PPP) kvote av den nederlandske LSH-sektoren med prosjektnummer LSHM16021 Organoider som nytt verktøy for toksikologimodellering til Hubrecht Organoid Technology (HUB) og HUB intern finansiering til sykdomsmodellering og toksikologiavdeling. Vi takker laboratoriene til Sabine Middendorp (Divisjon for pediatrisk gastroenterologi, Wilhelmina Children’s Hospital, UMC, Utrecht) og Hugo R. de Jonge og Marcel J.C. Bijvelds (Department of Gastroenterology and Hepatology, Erasmus MC, Rotterdam) for å gi innledende teknisk støtte til å sette opp monolayers på membraninnlegg.
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | Plates require REMS AutoSampler for TEER measurements |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | membrane inserts |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |