Developmental Biology

Tre og firedimensjonale visualiserings- og analysetilnærminger for å studere vertebrataksial forlengelse og segmentering

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/62086

André Dias¹, Gabriel G. Martins^1,2, Alexandre Lopes^1,3, Moisés Mallo¹

¹Instituto Gulbenkian de Ciência, ²Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, ³NOVA School of Science and Technology

Summary

Her beskriver vi beregningsverktøy og metoder som tillater visualisering og analyse av tre og firedimensjonale bildedata av museembryoer i sammenheng med aksial forlengelse og segmentering, oppnådd ved optisk totoprojeksjonstomografi, og ved levende avbildning og helmontert immunfluorescensfarging ved hjelp av multifotonmikroskopi.

Abstract

Somitogenese er et kjennetegn på virveldyr embryonal utvikling. I årevis har forskere studert denne prosessen i en rekke organismer ved hjelp av et bredt spekter av teknikker som omfatter ex vivo og in vitro tilnærminger. Imidlertid er de fleste studier fortsatt avhengige av analysen av todimensjonale (2D) bildedata, noe som begrenser riktig evaluering av en utviklingsprosess som aksial forlengelse og somitogenese som involverer svært dynamiske interaksjoner i et komplekst 3D-rom. Her beskriver vi teknikker som gjør det mulig for mus live bildeinnsamling, datasettbehandling, visualisering og analyse i 3D og 4D å studere cellene (f.eks. nevromesodermale forfedre) involvert i disse utviklingsprosessene. Vi tilbyr også en trinnvis protokoll for optisk projeksjonstomografi og helmontert immunfluorescensmikroskopi i museembryoer (fra prøvepreparering til bildeinnhenting) og viser en rørledning som vi utviklet for å behandle og visualisere 3D-bildedata. Vi utvider bruken av noen av disse teknikkene og fremhever spesifikke funksjoner i forskjellig tilgjengelig programvare (f.eks. Fiji/ImageJ, Drishti, Amira og Imaris) som kan brukes til å forbedre vår nåværende forståelse av aksial forlengelse og somittdannelse (f.eks. 3D-rekonstruksjoner). Til sammen understreker teknikkene her betydningen av 3D-datavisualisering og analyse i utviklingsbiologi, og kan hjelpe andre forskere til bedre å adressere 3D- og 4D-bildedata i sammenheng med virveldyraksial forlengelse og segmentering. Til slutt bruker arbeidet også nye verktøy for å lette undervisningen av virveldyr embryonal utvikling.

Introduction

Virveldyr kroppsaksedannelse er en svært kompleks og dynamisk prosess som oppstår under embryonal utvikling. På slutten av gastrulation [i musen, rundt embryonal dag (E) 8.0], en gruppe epiblast forfedre celler kjent som nevromesodermale forfedre (NMPs) bli en nøkkeldriver for aksial forlengelse i et hode til hale sekvens, generere nevrale rør og paraksial mesodermal vev under nakke, stamme og hale formasjon 1,2,3,4 . Interessant nok synes posisjonen som disse NMPene okkuperer i kaudal epiblast å spille en nøkkelrolle i beslutningen om å differensiere til mesoderm eller neuroectoderm⁵. Selv om vi for tiden mangler et presist molekylært fingeravtrykk for NMPer, er disse cellene generelt antatt å være co-express T (Brachyury) og Sox2 ^5,6. De eksakte mekanismene som regulerer NMP-skjebnebeslutninger (dvs. om de tar nevrale eller mesodermale ruter) begynner bare å bli nøyaktig definert. Tbx6 uttrykk i den primitive streken regionen er en tidlig markør for NMP skjebne beslutning, som dette genet er involvert i induksjon og spesifikasjon av mesoderm ^6,7. Interessant nok synes tidlige mesodermceller å uttrykke høye nivåer av Epha1⁸, og Wnt / β-catenin signalering, samt Msgn1 ble også vist å spille viktige roller i paraksial mesoderm differensiering og somite formasjon ^9,10. En komplett romlig-temporal analyse av NMPer på en encellet nivå vil sikkert være medvirkende til å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer mesoderm-spesifikasjonen fullt ut.

Dannelsen av somitter (ryggvirvler forløpere) er et sentralt trekk ved vertebrater. Under aksial forlengelse blir det paraksiale mesodermet segmentert i en rekke bilaterale repeterende enheter kjent som somitter. Antall somitter og tiden som kreves for dannelsen av nye segmenter varierer mellom art^11,12. Somitogenese innebærer periodiske signaloscillasjoner (kjent som "segmenteringsklokken") som kan observeres av det sykliske uttrykket for flere gener av Notch, Wnt og Fgf signalveier i det presomitiske mesodermet (f.eks. Lfng)^11,12. Den nåværende modellen av somitogenese postulerer også eksistensen av en "modningsbølgefront", en serie komplekse signalgradienter som involverer Fgf, Wnt og retinoinsyresignalering som definerer posisjonen til den bakre grensen til hver ny somite. En koordinert interaksjon mellom "segmenteringsklokken" og "modningsbølgefronten" er derfor grunnleggende for genereringen av disse ryggvirvlenes forløpermoduler, da perturbasjoner i disse viktige morfogenetiske prosessene kan resultere i embryonal dødelighet eller i dannelsen av medfødte misdannelser (f.eks. skoliose)13,14,15.

Til tross for betydelige nylige fremskritt innen avbildningsteknikker, bioimageanalysemetoder og programvare, er de fleste studier av aksial forlengelse og somitogenese fortsatt avhengige av enkle/ isolerte todimensjonale bildedata (f.eks. seksjoner), som ikke tillater full flerdimensjonal vevsvisualisering og kompliserer klar differensiering mellom patologiske misdannelser (dvs. på grunn av mutasjoner) vs normal morfologisk variasjon som oppstår under embryonisk utvikling¹⁶. . Imaging i 3D har allerede avdekket nye morfogenetiske bevegelser, tidligere ikke identifisert av standard 2D-metoder 17,18,19,20, fremhever kraften i toto avbildning for å forstå mekanismene for virveldyr somitogenese og aksial forlengelse.

3D- og 4D-mikroskopi av museembryoer, spesielt levende avbildning, er teknisk utfordrende og krever kritiske trinn under prøvepreparering, bildeinnhenting og forhåndsbehandling av data for å muliggjøre nøyaktig og meningsfull romlig-temporal analyse. Her beskriver vi en detaljert protokoll for levende avbildning og helmontert immunfluorescensfarging av museembryoer, som kan brukes til å studere både NMPer og mesodermale celler under aksial forlengelse og segmentering. I tillegg beskriver vi også en protokoll for optisk projeksjonstomografi (OPT) av eldre embryoer og fostre, som gjør det mulig for 3D i to visualisering og kvantifisering av patologiske abnormiteter som kan oppstå somitogenese (f.eks. benfusjon og skoliose)13,21,22. Til slutt illustrerer vi kraften i 3D-avbildningsrekonstruksjoner i studiet og undervisningen av virveldyrsegmentering og aksial forlengelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter som involverte dyr fulgte den portugisiske (Portaria 1005/92) og europeiske (direktiv 2010/63/EU) lovgivning om bolig, husdyrhold og velferd. Prosjektet ble gjennomgått og godkjent av Etikkkomiteen i 'Instituto Gulbenkian de Ciência' og av den portugisiske nasjonale enheten Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (lisensreferanse: 014308).

1. Prøvepreparering for 3D- og 4D-avbildning

MERK: Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan du dissekerer og forbereder musen E8.25 til E10.5 embryoer for levende avbildning (1.1), E7.5 til E11.5 embryoer for hel mount immunfluorescence mikroskopi (1.2) og fostre for optisk projeksjon tomografi (1.3).

Eksempelforberedelse for levende avbildning
1. Musembryo disseksjon og forberedelse for levende avbildning (f.eks. LuVeLu reporter ²³).
  1. Disseker museembryoer mellom E8,25 og E10,5 i forvarmet M2-medium (37 °C). Fjern eggeplommesekken forsiktig ved hjelp av rene tang og vask embryoet en gang med friskt M2-medium for å fjerne blod og rusk som produseres under disseksjonen.
    MERK: Det er viktig å unngå å skade embryoet på noen måte, ellers vil det ikke utvikle seg riktig under live avbildningsprosedyren.
  2. Under live imaging prosedyren, inkubere embryoer i et oppvarmet kammer (37 °C), i en 65% O₂ og 5% CO₂ miljø (N₂ balansert), i lav glukose DMEM medium supplert med 10% HyClone definert foster bovine serum, 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin.
    MERK: Disse kulturforholdene tillater embryonal utvikling i rundt 10 timer. Andre protokoller ^9,10, ved hjelp av forskjellige kulturforhold, kan tillate enda lengre perioder.
Prøvepreparering for immunfluorescensmikroskopi
1. Museembryo disseksjons- og fikseringsprosedyre
  1. Disseker museembryoer fra E7,5 til E11,5 i enten kaldt (4 °C) fosfatbufret saltvann (PBS) eller M2-medium. Etter fjerning av alle ekstra-embryonale membraner (f.eks. Reicharts membran eller eggeplomme sac) vask embryoet i fersk PBS for å fjerne blod og rusk produsert under disseksjonsprosedyren.
  2. Fest embryoer ved 4 °C, i 4 % paraformaldehyd (PFA) i PBS, for den tiden som er angitt i tabell 1.
    FORSIKTIG - PFA skal håndteres inne i en avtrekkshette
    
    Utviklingsstadium Anbefalt fikseringstid (PFA 4 %)
    
    E7.5 1t30
    
    E8.5 2t
    
    E9.5 3t
    
    E10.5 4t
    
    E11.5 4t
    
    Tabell 1 - Fikseringstider for embryoer i ulike utviklingsstadier
  3. Etter fiksering, vask embryoer minst to ganger (5-10 min hver) i PBS for å fjerne PFA helt. På dette tidspunktet kan embryoer tas rett inn i immunfluorescensfargingsprotokollen (trinn 1.2.2) eller kan dehydreres og lagres for fremtidig bruk (trinn 1.2.1.4).
  4. Oppbevar om nødvendig embryoer ved -20 °C i 100 % metanol i lange perioder.
    1. For å forbedre vevsbevaring, dehydrere embryoet gradvis med 10% økning i metanolkonsentrasjon (fortynnet i PBS), hvert trinn 10 min ved romtemperatur (RT) på en shaker, til den når 100% metanol. Bytt ut 100% metanol en gang ved hjelp av en frisk aliquot.
    2. Gjenopprett frosne embryoer ved rehydrering etter en omvendt metanol/PBS-serie, hvert trinn 10 min ved RT på en shaker, og med sluttvask i PBS (to ganger, 5-10 min hver) før du går inn i immunstainingsprotokollen.
      FORSIKTIG - Metanol skal håndteres inne i en avtrekkshette.
2. Helmontert immunfluorescensfarging
  MERK: Følgende immunfluorescensfargingsprotokoll ble tilpasset fra prosedyren beskrevet i Osorno et ^al.24. Alle vasker skal utføres på en shaker. Etter blokkeringstrinnet utføres inkubasjoner ved 4 °C for å sikre antistoffintegritet/bevaring.
  1. Vask embryoer tre ganger (30 min hver) i PBS som inneholder 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST) og deretter en gang i 0,5% PBST i 1 time (RT) for å forbedre permeabilisering.
  2. For å redusere ikke-spesifikk binding, vask i 1 M glycin i PBS (pH 7,5) i 30 min ved RT.
  3. Vask tre ganger i 0,1% PBST i 30 min for å fjerne glycinet helt.
  4. Inkuber embryoene over natten ved 4 °C i blokkeringsløsning som inneholder: 3 % av serumet (fra dyreartene der de sekundære antistoffene ble produsert), 1 % av bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 % av Triton X-100, i PBS.
  5. Fortynn primære antistoffer i blokkeringsløsning (normalt 1:200 for T- og Sox2-antistoffer) og inkuber i to til tre dager ved 4 °C.
  6. Før du tilsetter sekundære antistoffer, vask embryoer tre ganger (30 min hver) i 0,1% PBST ved 4 °C. Fortynn sekundære antistoffer i blokkeringsløsning (1:1000) og inkuber i 2 dager ved 4 °C, beskyttet mot lys.
  7. Vask embryoer seks ganger (30 min hver) i 0,1% PBST ved 4 °C.
  8. For kjernefysiske motsendelser, inkuber embryoer i 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI), fortynnet 1:500 i PBST, over natten på en shaker ved 4 °C, beskyttet mot lys.
  9. Til slutt, vask embryoer tre ganger (30 min hver) i 0,1% PBST ved 4 °C.
3. Vevsrydding og glideforberedelse
  1. Vevsrydding ved bruk av metylsilisylat eller en blanding av benzylalkohol med benzylbenzoat (BABB)
    1. Før du fjerner ved hjelp av metylsilisylat eller BABB, må du dehydrere embryoer fullstendig ved å bringe dem til 100 % metanol, gjennom en metanol/PBS-serie som består av påfølgende 10 % økning i metanolkonsentrasjon (inkubasjonstider på 10 minutter hver ved 4 °C). For å oppnå fullstendig dehydrering, erstatt 100% metanol for en frisk og vent i ytterligere 10 minutter.
    2. Utfør embryorydding ved å legge inn i en rekke metylsililat eller BABB i metanol med 20% påfølgende økning i konsentrasjon, 20 minutters inkubasjon for hvert trinn. Når metylsilisylat- eller BABB-oppløsningen når 100% gjør to ekstra endringer for en ny løsning.
      FORSIKTIG: Både metylsilisylat og BABB skal håndteres inne i en avtrekkshette.
      MERK: For riktig rydding er det viktig at embryoer er fullstendig dehydrert. Det er også viktig at metanol er fullt blandet med metylsilisylat eller BABB i clearingløsningsserien.
    3. Etter at embryoene blir helt gjennomsiktige, håndter dem individuelt, ved hjelp av fortrinnsvis et fluorescenssteroskop, for å redusere sjansene for vevsskade.
    4. For avbildning, monter embryoer i enten en 75 mm x 25 mm depresjon konkav glasssklie eller en 20 mm x 60 mm # 1,5 coverglass. Sistnevnte alternativ vil tillate avbildning fra begge sider, om nødvendig, men det er mye mer skjøre og vanskelig å forsegle. Overfør embryoer til mikroskopet glir ved hjelp av en tannpirker, en fin bomullsspiss, en Pasteur pipette eller et annet lignende instrument.
    5. For å unngå å komprimere embryoene, tilsett avstandsstykker laget av #1 coverglassskår (170 μm tykk), silikon eller tynne metallskiver. Tilsett deretter en dråpe monteringsmedium, dekk med et dekkglass og tetning #1 eller #0 20x20 mm.
    6. Hvis du bruker glass- eller metall avstandsstykker, forsegle med smeltet paraffin for bedre å stabilisere preparatet - ikke forsegle med neglelakk fordi det oppløses med metylsilisylat eller BABB. For å unngå bobler, plasser dekslene på den ene siden og skyv den deretter gradvis og forsiktig sidelengs; legge til mer medium om nødvendig.
      MERK: Se videoen for bedre å forstå hvordan du manipulerer de ryddede embryoene og hvordan du monterer dem på mikroskopet.
  2. Vevsrydding med RapiClear
    1. Ved bruk av RapiClear er det ikke nødvendig med embryodehydrering. Etter trinn 1.2.2.9, plasser embryoer i midten av en 75 mm x 25 mm depresjon konkav glasssklie, fjern all PBST i mikroskopdepresjonsskuffen og tilsett 200 μL clearingløsning.
    2. Etter 10 min beskyttet mot lys, når embryoer begynner å bli gjennomsiktige, bytt ut ryddeløsningen, vent ytterligere 20 minutter (beskyttet mot lys) og topp deretter med en dekslelip, starter fra den ene siden og beveger seg forsiktig mot den andre.
      MERK: Tiden for å fjerne embryoet fullt ut kan gå fra noen minutter til over natten, avhengig av stadium og størrelse på embryoer. Hele prosessen bør også gjøres under et stereomikroskop. For bedre å forstå ryddingen og mikroskopets lysbildeforberedelse, se videoprotokollen.
Prøvepreparering for optisk projeksjonstomografi
MERK: Følgende prosedyrer ble tilpasset fra tidligere protokoller¹⁹^,²⁵^,²⁶. Protokollen vil bli beskrevet for analyse av E18.5 musefostre.
1. Mus fetus disseksjon og fiksering prosedyre
  1. Disseker E18.5 musefostre i kald (4 °C) PBS, fjern alle ekstra-embryonale membraner og vask deretter fostrene flere ganger i fersk PBS for å fjerne blod og rusk produsert under disseksjonsprosedyren.
  2. Fest fostre i 4% PFA laget i PBS, ved 4 °C i 5 til 7 dager.
  3. Vask fostre en gang (15 min) i PBS og deretter tre ganger (30 min hver) i demineralisert vann eller PBS. Utfør vaskene på en shaker.
  4. Dehydrer fostrene ved inkubasjon (25 min-serien ved RT på en shaker) i metanolløsninger med økende konsentrasjoner (10% økning fortynnet i demineralisert vann eller PBS) til 100% metanol.
  5. Bytt 100% metanoloppløsning (bruk en fersk aliquot) tre ganger (20 min hver) for å sikre fullstendig dehydrering. Embryoer kan deretter lagres ved -20 °C eller tas direkte (en dag senere) til blekingsprosessen (trinn 1.3.2).
2. Bleking prosess
  1. For å fjerne den naturlige pigmenteringen, inkubere fostre (separat) på en shaker, først for en dag i 5% H₂0₂ i metanol og deretter i 10% H₂0₂ i metanol i opptil 3 dager til embryoene mister all naturlig pigmentering.
    FORSIKTIG: H₂O₂skal håndteres forsiktig inne i en avtrekkshette. Blekeløsningen som inneholder H₂O₂når den kommer i kontakt med prøven, skaper damper, og derfor bør røret som inneholder fostrene forbli åpent under hele blekingsprosedyren. Noen blekeprotokoller antyder kombinasjonen av H₂O₂med formamid. Hvis dette alternativet brukes, må det utvises ekstra forsiktighet, da tilsetning av H₂O₂til ufortynnet formamid kan føre til eksplosjon.
  2. Gradvis rehydrere embryoene i en omvendt metanolserie (med 10% reduksjon) i demineralisert vann, hver inkubert i 20 min ved RT på en shaker, og til slutt vaske tre ganger (30 min hver) i demineralisert vann. Vent en dag, bytt det demineraliserte vannet og fortsett videre.
    MERK: Se supplerende figur 1 for et representativt resultat av blekingsprosessen.
3. Demineraliseringsprotokoll
  MERK: Demineralisering er valgfritt, men anbefales for fostre eller valper.
  1. Utfør demineralisering ved å vaske fostrene i 0,1 M EDTA ved 42 °C i noen timer [se også Cho et ^al.27] etterfulgt av fem vasker (20 min hver) med demineralisert vann for å fjerne EDTA helt. Utfør alle prosedyrer på en shaker.
4. Prøvepreparering for rydding
  1. Bygg inn fostre i en 1% agarose blokk. For å forberede disse blokkene fylle en 50 ml plastrør eller sprøyte (bygge et sylindrisk rom ved å kutte av sprøytens utgangsside og bruke stempelet til å blokkere motsatt side) med smeltet agarose, plasser fosteret i agarose i vertikal stilling og hold denne posisjonen i midten av blokken ved hjelp av tang under størkning av agarose.
  2. Plasser formen med blokken ved 4 °C (30 min) slik at agaroseen kan geleides helt. Ved feil posisjonering av fosteret i blokken eller utseendet på luftbobler, smelt agarose ved å plassere blokken ved 50 °C over natten, og gjenta prosedyren neste dag.
  3. Fjern agaroseblokken med fosteret fra formen og legg det i en beholder med demineralisert vann. Skift ut med friskt demineralisert vann etter 15 min.
  4. Før du rydder med BABB, dehydrer prøven. For bedre å bevare vevsintegriteten, utfør fosterdehydrering gradvis med 10% økning i metanolkonsentrasjon (fortynnet i demineralisert vann eller PBS), hvert trinn i mer enn 45 min ved RT på en shaker, til de når 100% metanol.
  5. Endre 100% metanol (bruk en frisk aliquot), først fire ganger i en time intervaller og deretter igjen påfølgende dag for å sikre fullstendig dehydrering.
5. Tømmeprosess og prøvemontering for OPT-avbildning
  1. Fjern fostrene på en shaker gjennom en serie (2,5 timer hver) BABB-løsning i metanol, med 25% økning i BABB-konsentrasjonen, til den når 100% BABB.
  2. Bytt ut BABB-løsningen med en frisk hver dag, til fosteret er helt gjennomsiktig. Denne prosessen kan ta 3 til 5 dager. Hold blokken som inneholder fosteret, på en shaker under hele prosedyren. Fostre kan oppholde seg i 100% BABB-løsning i lange perioder.
    MERK: Hvis fosteret ikke er riktig dehydrert, blir det litt gjennomskinnelig ("hvitaktig" emulsjon) etter først å ha tilsatt BABB. Hvis dette skjer, gå tilbake til ren metanol og utfør to ekstra vasker i frisk metanol. Kjøl aldri prøver mens du utfører dehydrering og rydding, da temperaturendringene kan føre til vannkondensasjon.
  3. Fest den slettede agaroseblokken til motoraksen til OPT-skanneren, juster optikken for å få et bilde av hele fosteret og fortsett med å skaffe et fullstendig projeksjonsdatasett^19,28.

2. Oppkjøp av mikroskop/bilde

For riktig 3D- og 4D-avbildning velger du mikroskopet som passer best til det eksperimentelle målet. Tabell 2 gir generell informasjon som leder gjennom utvalget.

Optiske mikroskopiteknikker	Bildeprinsipp	Eksperimentelt mål og hensyn
Widefield-bildebehandling	Bruker fluorescens, reflektert eller overført lys.	Ideell for en rask og generell oversikt over embryoet (f.eks. for screening og for å vurdere utviklingsstadier og åpenbare fenotyper). Den reduserte dybdeskarpheten, sammenlignet med den observerbare tykkelsen ved høye forstørrelser, tillater ikke nøyaktig tolkning eller analyse av 3D-morfologi.
Confocal (laserskanning; CLSM)	Bruker laserskanning belysning og deteksjon av fluorescens gjennom et pinhole.	Tillater avbildning av optiske skiver av fluorescerende merkede prøver, ideelt med et sterkt signal. Avbildning gjennom et hull fjerner signalet fra dypfeltet, og tillater dermed nøyaktig diskriminering av informasjon i 3D. Oppkjøpet er størrelsesordener langsommere enn widefield, men med uovertruffen kontrast og 3D-diskriminering av morfologi. Høy temporal oppløsning kan ikke oppnås fordi bilder anskaffes 1 piksel om gangen. Bra for 3D-avbildning av faste museembryoer opp til E9.5. Avbildning gjennom hele presomitisk mesoderm eller somites krever vevsrydding, på grunn av lysspredning i dypere vev. Fototoksisitet og bleking er en vurdering. Photobleaching kan, innenfor grenser, kompenseres som en posteriori. Fototoksiske effekter i levende prøver kan imidlertid ikke, og er ofte ikke enkle å bestemme. Dette er tydeligere hvis prøver viser lavt uttrykk, og høylaserkrefter er nødvendig.
To-foton eksitasjon fluorescens (TPEFM)	Den bruker pulserende nær-infrarød (NIR) lasereksitasjon i stedet for synlig laserbelysning.	TPEFM tillater optisk kutting gjennom tykkere prøver enn CLSM. Oppløsningen er litt lavere, men kontrasten i dypere vev er betydelig bedre, noe som gjør den ideell for levende avbildning av museembryoer. Selv om TPEFM ofte betraktes som mindre fototoksisk enn konvensjonell CLSM, krever det høye laserkrefter som også kan ha skadelige effekter på celler og vev. Ideell for 3D-avbildning av embryoer opp til E11,5, selv om avbildning gjennom hele presomitisk mesoderm fortsatt krever vevsrydding.
Confocal (spinnende disk)	En form for konfokal som, i stedet for en enkelt laser, bruker flere punktlignende kilder.	Bruken av flere punktlignende strukturer gir raskere opprettelse av optiske skiver (flere bilder per sekund eller stabler per minutt er oppnåelige) enn CLSM. Oppkjøpet er praktisk talt like raskt som bredt, med rimelig 3D-diskriminering. Det tillater imidlertid bare avbildning av de mest overfladiske vevene i museembryoet. Tillater mer sensitiv deteksjon enn CLSM, noe som gjør det til et alternativ for embryoer med lavt uttrykk for fluorescensproteiner.
Lysark / enkeltplan (LSFM/SPIM)	I stedet for widefield eller punktlignende belysning, er prøven opplyst ett ortogonalt plan om gangen. I de fleste konfigurasjoner tillater det avbildning fra flere vinkler.	Krever også fluorescerende merkede prøver. Oppkjøpet av optiske skiver oppkjøpet er ekstremt raskt (flere rammer per sekund) og har redusert effekt av fototoksisitet eller bleking. Hvis det kreves flervisning, kan det imidlertid ta timer/dager med beregning på etterfølgende forhåndsbehandlingstrinn for datasett. LSFM/SPIM gir bedre deteksjon av lavere uttrykksnivåer enn CLSM. Ideell for 3D-avbildning av in toto museembryoer under gastrulation. Prøver må ofte monteres og vedlikeholdes i suspensjon (ukonvensjonelt preparat).
Optisk projeksjonstomografi (OPT)	Optiske skiver oppdages ikke, men beregnes fra en serie widefield-bilder av hele embryoet fra forskjellige vinkler ("projeksjonene").	Ideell for 3D-avbildning av senere stadier museembryoer / fostre (>5mm), men bare fast og ryddet. Har fordelen av å produsere 3D-stabler av optiske skiver av både fluorescerende og ikke-fluorescerende prøver. Datasett er isometriske (skiver med lik oppløsning i alle tre dimensjonene) noe som gjør det ideelt for anatomisk analyse. Anskaffelse av et projeksjonsdatasett kan kreve bare noen få minutter, etterfulgt av 15-30 min rekonstruksjon.
Optisk koherenstomografi (OCT)	Bruker NIR-belysning gjennom prøven for å oppnå optiske skiver basert på interferens med lysrefleksjon.	OCT tillater enkel avbildning gjennom levende vev (noen få millimeter dypt inn i prøven uten fluorescerende kontrast) med noen få dusin mikrometer oppløsning. Oppkjøpet er veldig raskt (noen få skiver per sekund). Selv om det er et mulig alternativ for OPT, er denne teknikken ikke allment tilgjengelig.
Superoppløsning (SR), atomkraft (AFM) eller nærfeltsavbildning (NSOM)	SR er normalt basert på enkeltmolekyl lokalisering og AFM/ NSOM på skanneflater ved sub-diffraksjonsoppløsninger (få nanometer).	Tillater avbildning på underdiffraksjonsnivå (<200nm oppløsning), ofte med den hensikt å oppdage enkeltmolekyler eller molekyler på celleoverflaten. Ikke ideell for morfologisk analyse av store prøver som museembryoer. Anskaffelsen er vanligvis en langsom prosess (sekunder til minutter per bilde).

Tabell 2 - Generell informasjon for å veilede valg av bildeteknikk/mikroskop som er mer egnet for forskerens spesifikke eksperimentelle mål.

3. Forhåndsbehandling av bildedatasett

MERK: Her fremhever vi noen av de viktigste trinnene i forhåndsbehandling av bildedatasett, nemlig støyreduksjon (3.1) og dekonvolusjon (3.2), og gir algoritmer som tillater riktig tilberedning og forhåndsbehandling av 3D-datasett tidsserier (3.3) og helmonterte immunofluorescence farginger (3.4). Til slutt angir vi referanser som i detalj beskriver en protokoll for forhåndsbehandling og rekonstruksjon av OPT-datasett.

Støyreduksjon
1. Hvis bildene viser redusert signal-til-støy-forhold, kan du vurdere å bruke en klassisk metode som et "Median" -filter eller "Anisotropic diffusjon" tilgjengelig i Fiji / ImageJ²⁹, eller en mer forseggjort metode basert på maskinlæring som "CARE"³⁰ eller "Noise2Void"³¹.
  MERK: Dette er spesielt relevant for datasett for levende bilder, der fotobleaching og fotodamage er en stor bekymring, og lavere eksponeringer og høyere detektorgevinster er nødvendig.
Dekonvolusjon
1. Hvis bildene ble anskaffet med høy oppløsning (nær eller ved Nyquist-sampling) bør du vurdere å utføre bildegjenoppretting med dekonvolusjon for å forbedre kvaliteten på datasettet før analyse. Vær oppmerksom på at noen dekonvolusjonsverktøy også inkluderer et denoising trinn.
  MERK: Dette har blitt omfattende omtalt i Krull et ^al.32 og i dokumentasjon tilgjengelig på Huygens deconvolution programvare nettsted (https://svi.nl/HomePage).
Klargjøre en tidsserie for 3D-datasett for riktig visualisering og analyse
MERK: Ofte kan embryo- eller scenedrift oppstå under tidsforløpavbildning. Dette må korrigeres før analyse utføres. Noen ganger er driften alvorlig nok til at oppkjøpet må avbrytes og justeringer gjøres. I dette tilfellet er det best å beholde de samme X-, Y- og Z-dimensjonene.
1. Separate 4D-stabler kan settes sammen til en enkelt 4D-hyperstakk ved hjelp av Fijis "sammenkoblingsfunksjon". Dette verktøyet håndterer imidlertid ikke kompositt / hyperstakker, så det er nødvendig å konvertere alle 4D-segmenter til enkle stabler ved hjelp av operasjonen Image | Hyperstakker | Hyperstakk som skal stables. Hold litt nummereringssystem for å opprettholde rekkefølgen på disse 4D-segmentene og noter informasjonen om hver enkelt (kanaler, stykker, tidspunkter). Gjenta prosedyren for alle segmenter, og sett dem deretter sammen ved hjelp av prosedyren Bilde | Stabler | Verktøy | Kjede sammen.
2. Rekonstruer den sammenkoblede hyperstakken med operasjonen Bilde | Hyperstakker | Stable til Hyperstack og velg riktig rekkefølge av de forskjellige dimensjonene. Undersøk Hyperstack for å sikre at alle dimensjoner er riktig sekvensert.
  MERK: Antall kanaler (c) og stykker (z) må være det samme for alle 4D-segmenter; Antall (tid) Rammer (t) må være lik summen av tidspoeng som er lagt til for alle 4D-segmenter. Det er viktig å bla gjennom stakken for å forstå hvordan de forskjellige dimensjonene interpoleres, før du utfører konverteringen til hyperstakk. Fiji/ImageJ-standard er vekslende kanaler, deretter vekslende Z-stykker og deretter vekslende tidspunkter ("XYCZT"). Bekreft at dette gjelder dataene som genereres av mikroskopet.
3. Velg Sammensatt som visningsmodus, og lagre som TIFF (Tagged Image File Format). For store datasett bør du vurdere å konvertere til BigDataViewer^33-format ved å utføre operasjonen Plugins | BigDataViewer | Eksporter gjeldende bilde som XML/HDF5. Dette genererer et datasett som kan blas mer effektivt og i 3D ved hjelp av BigDataViewer og kan håndteres av andre Fiji / ImageJ-verktøy for stordatadatasett.
4. Registrer den sammenkoblede hyperstakken (tidsserier av 3D-stabler) for å kompensere for embryo/ scenedrift ved hjelp av enten "Correct 3D Drift" ImageJ plugin³⁴ eller BigStitcher plugin³⁵, avhengig av graden av driftkorrigering som trengs. XML / HDF5-filer kan åpnes med BigStitcher.
  MERK: Det er nødvendig å utføre registreringen av 3D-tidsforløp som viser embryodrift før et forsøk på å utføre cellesporing eller bevegelsesanalyse; korrigering for drift er også nødvendig for å tolke morfogenetiske bevegelser riktig.
Forhåndsbehandling av datasett for immunfluorescensavbildning
1. Z-dybde signal demping
  MERK: Selv om metoden vi foreslår å korrigere signaldemping kan være nyttig, bør dette brukes nøye, da ofte mindre signal i dybden faktisk kan gjenspeile et biologisk og ikke et optisk fenomen. Vurder å måle forfallet i et område av vev der molekylet av interesse ikke forventes å være til stede eller uttrykt og justere kompensasjonen for det området. Hvis det fortsatt er et lavere positivt signal i dybden, kan det avsløre et faktisk biologisk fenomen. Tenk også på at noen områder av prøven kan gi mer spredning eller laserdemping enn andre, og at den ikke vil bli fullstendig korrigert med denne enkle metoden.
  1. For tykkere/senfase embryoer kan stråledemping, fotobleaching og sfærisk avvik forårsaket av manglende brytning av brytningsindekser (mellom monteringsmediet og mikroskopmålet) resultere i datasett der fluorescensintensiteten er sterkt svekket i de dypere skivene i Z-stabelen. Kompenser derfor for dette signaltapet før analyse. Å bestemme analytisk den mest nøyaktige dempingen er kompleks og svært utvalgsavhengig³⁶, men en rask tilnærming kan bestemmes empirisk i ImageJ / Fiji ved hjelp av Process | Matte | Makrofunksjon og klikk på Forhåndsvisning.
  2. Last inn Z-stakken i Fiji/ImageJ, og utfør deretter prosedyren Bilde | Stabler | Reslice. Start på: øverst, hold Unngå interpolering krysset av og OK. Nå vil "Z" være "Y" -aksen. Deretter gjør du bilde | Oppslagstabeller (LUT) | Brann (eller andre flerfargede LUT). Dette vil bidra til å vurdere visuelt den beste kompensasjonen i løpet av de neste trinnene. Bytt til et stykke midt i embryoet, hvor effekten av demping i dybden er tydelig synlige (intensiteten faller fra toppen [overfladisk] til bunnen [dypere]).
  3. Fortsett med å bestemme korrigeringen av det vertikale ("y") intensitetsfallet med prosedyren Prosess | Matte | Makro, og legg til følgende "Kode" nøyaktig slik det er skrevet her:
    v = v * A * exp ( B * y /h )
    I dette uttrykket er "v" variabelen for pikselintensitet (som justeres som en funksjon på dybden), "y" variabelen for dybde og "h" for full dybde, og "exp" er en eksponentiell funksjon; "A" bør erstattes med et tall mellom 0,5 og 1,0 (velg lavere verdier for å unngå overmetning av de øverste lagene i Z-stakken); B erstattet med et tall mellom 0,5 og 2,0, avhengig av hvor alvorlig Z-dybdedempingen er - ideelt sett bør den være 1, men i noen tilfeller er mindre (eller mer) nødvendig for å kompensere bunnlagene riktig; En høyere verdi av B vil resultere i mer dempingskompensasjon. Klikk på Forhåndsvisning for å gjøre en første vurdering. Test forskjellige verdier av A og B til du får tilstrekkelig kompensasjon fra topp til bunn i bildet ("Brann" LUT kan være nyttig for denne vurderingen). Når du er fornøyd, bruker du innstillingene ved å klikke OK.
    MERK: Dette må utføres i hver kanal individuelt, fordi rødskiftede fargestoffer og lasere kan dempe mindre, og noen fargestoffer blekes raskere enn andre. Husk at denne prosedyren kanskje ikke er nøyaktig nok til å tillate pålitelig kvantifisering av fluorescensintensitetsvariasjoner i dybden, selv om den absolutt er mer pålitelig enn å utføre kvantifiseringer direkte i det opprinnelige 3D-datasettet som er sterkt påvirket av demping av signal i dybden. En måte å identifisere og kontrollere for denne effekten, er å sammenligne avbildning av forskjellige embryoer fra dorsale eller ventrale sider.
  4. Gjenopprett den opprinnelige geometrien til den kompenserte Z-stakken ved å gjøre bilde | Stabler | Reslice, start øverst, hold Unngå interpolering krysset av, og nå må "Y" bli "Z" -planet igjen; erstatte fargen ved å utføre "Bilde | Slå opp tabeller | Gråtoner" (eller den andre LUT-en du velger). Kast den opprinnelige ikke-kompenserte z-stakken, og lagre den kompenserte versjonen.
    MERK: Se Supplerende figur 2 som et representativt resultat av Z-dybdesignaldempingsmetoden.
2. Skaleringskorrigering av Z-akse
  1. Hvis avbildning med et mål designet for en brytningsindeks som er forskjellig fra den som brukes til å montere embryoene, er det nødvendig å utføre reskalering av stykketykkelsen, ellers vil målinger i dybden være feil (potensielt med 50% hvis du bruker et "tørt" mål på et vevsklarert embryo). Dette forklares, gjennomgås og de ulike metodene diskuteres, i ³⁷ og ³⁸. Å bestemme analytisk den faktiske Z-akseforvrengningsskalaen er kompleks, men en akseptabel tilnærming kan lett bestemmes ved å finne forholdet mellom brytningsindeksen i prøven og brytningsindeksen til målet (f.eks. 1,53/1,0 for et metylsylatklarert embryo avbildet med et tørt 20 x objektivt, eller 1,56/1,33 for et embryo som er klarert med BABB og avbildet med en vannsenking).
  2. Når Z-stack-datasettet allerede er åpnet i Fiji/ImageJ (for flerkanalsbilder, etter at de er satt sammen som "sammensatte" med alle kanaler), går du til Bilde | Egenskaper og endre Voxel-dybden til stykketykkelsen som oppnås under bildeanskaffelse multiplisert med Z-aksens skaleringskorrigering som ble bestemt i forrige trinn (4.2.1; Delen "Forhåndsbehandling av bildedatasett"). Bekreft resultatet ved hjelp av Bilde-| Stabler | Ortogonale visninger.
3. Omplassering av embryo til en anatomisk standardposisjon ved hjelp av Fiji/ImageJ
  MERK: Omplassering av embryoet (se fordelene som er fremhevet i Supplerende figur 3) til en standardisert fremre bakre [A-P] og dorsal-ventral [D-V] akseposisjon ved hjelp av Fiji / ImageJ, krever installasjon av TransformJ ³⁹ pakke med plugins fra Fijis "ImageScience" oppdateringsnettsted.
  MERK: Denne teknikken er å foretrekke fremfor runder med rotasjoner i de tre planene som vil introdusere aliasartefakter og nedbrytning av oppløsning. Fordi plugin-modulen fiji/imagej 3D-visningsprogram ikke kan håndtere riktig datasett som er større enn 200-300 Mb (plugin-modulen gjengis kanskje ikke eller viser uforutsigbar virkemåte når du prøver å rotere visningsvinkelen), må det opprinnelige 3D-datasettet tas ned først.
  1. Begynn med å redusere størrelsen på datasettet i Fijis | Skaler og sett inn X-, Y- og Z-skaleringsverdiene som er nødvendige for å redusere datasettet til mindre enn 200 Mb (for eksempel vil et 0,5 x 0,5 x 0,5-sampling resultere i et datasett som er 8 ganger mindre). Kontroller at det er merket av for Opprett nytt vindu .
  2. Gå deretter til Plugins | 3D-visningsprogram. Inne i 3D-visningsprogrammet klikker du over embryoet for å velge det, og en rød 3D-boks skal vises. Når du bruker denne modusen (med den røde boksen aktivert), kan rotasjonen av datasettet styres med musen, i motsetning til standard virkemåte, som er å rotere visningsvinkelen. Når du omplasserer embryoet med musen, må du aldri klikke utenfor, ellers deaktiveres datasettet.
  3. Når du er fornøyd med embryoets nye posisjon, velger du Rediger | Transformasjon | Eksporter transformert bilde i menyen i "3D Viewer" -vinduet. For å inspisere de forskjellige ortogonale flyene, gå til Bilde | Stabler | Ortogonale visninger. Hvis embryoet ikke er riktig plassert, lukker du vinduet og går tilbake til 3D-visningsprogrammet og justerer det på nytt. Gjenta trinn 4.3.2.
  4. Når embryoet er riktig plassert, velger du fra "3D Viewer" -vindusmenyen Rediger | Transformasjon | Lagre transformering og lagre transformasjonsmatrisen i en tekstfil med filtypen *.mat. Åpne denne tekstfilen ved hjelp av Fiji/ImageJ, fjern de to første linjene (tekst) og lagre på nytt. Dette oppretter en transformasjonsmatrisefil som er kompatibel med plugin-modulen "TransformJ" som er beskrevet i ³⁹.
  5. Bytt til datasettet med full oppløsning (kan være en sammensatt hyperstakk med flere kanaler) og utfør operasjonen Plugins | TransformJ | TransformJ affine. Bla gjennom i det nye vinduet for å søke etter matrisefilen som er lagret tidligere, velg Interpolering av kubikk B-Spline-| oppdater isotropisk | Greit.
    MERK: Denne operasjonen er minne- og CPU-intensiv. Operasjonen kan ta fra minutter til timer, avhengig av størrelsen på arbeidsstasjonen og datasettet. Bruken av det resample isotropiske alternativet garanterer at ingen oppløsning går tapt under transformasjonsoperasjonen, slik at datasettet vil øke i størrelse betydelig og ikke lenger vil være anisotropisk som den opprinnelige konfikale z-stakken; Det forventes at antall stykker i Z-aksen øker til samme antall X- og Y-piksler for hvert stykke, og stakken oppblåst til 5-10 ganger den opprinnelige størrelsen. Dette er nødvendig for å garantere at ingen informasjon går tapt i løpet av interpolering av voxels under rotasjon og oversettelse.
  6. Når embryoet er riktig omplassert, er det ofte mulig å trimme det meste av det tomme rommet som er opprettet rundt embryoet. Utfør en fullstendig Z-projeksjon Image | Stabler | Z-prosjekt... og velg Maksimal intensitet; tegn minimum avkastning som inneholder hele embryoet i X og Y. Bytt til de opprinnelige datasettbildevinduene, gå til Rediger | Merket område | Gjenopprett markeringen, og beskjær ved å velge Bilde | beskjær.
  7. Trim skivene i begynnelsen og slutten som ikke krysser embryovev. Velg Bilde | for dette Stabler | Verktøy | Slice remover og angi den første og siste sektoren som skal fjernes, og sørg for å endre "økningen" til 1 (ellers fjerner den bare alle andre stykker).
  8. Når du har omplassert og trimmet det nye datasettet, må du lagre som en ny TIFF-fil. Hvis dette datasettet er for stort (mer enn GPU RAM), bør du vurdere å bruke BigDataViewer til å eksportere som XML/DHF5, som forklart i trinn 3.3 (fra delen "Forhåndsbehandling av bildedatasett").
FORHÅNDSBEHANDLING OG rekonstruksjon av OPT-datasett
1. Bruk protokollen for forhåndsbehandling og rekonstruksjon av OPT-datasett som er beskrevet i Martins et ^al.19 og Gualda et ^al.28.

4.3D gjengivelse, visualisering og analyse

MERK: Her gir vi en liste over mulige applikasjoner av forskjellige programvareverktøy, som tillater eller forbedrer visualisering og analyse av 3D-bildedatasett.

3D-gjengivelse og visualisering ved hjelp av Drishti
MERK: Drishti⁴⁰ er en gratis vitenskapelig visualiseringsprogramvare designet for å utforske og presentere 3D- og 4D-datasett fra mikro-CT, konfokal / multifoton og lysarkmikroskopi. Her bruker vi denne programvaren for 3D-gjengivelse og visualisering av helmontert immunfluorescensfarging (trinn 2; "Eksempelforberedelse for 3D-bildebehandling"). Det er flere opplæringsprogrammer på nettet for å hjelpe brukerne med å forstå hvordan de skal betjene Drishti; søk på nettet etter "Ajay Limaye Drishti 3D tutorials". Drishti kan ikke lese bunker med TIFF-filer direkte, så de må konverteres først til det opprinnelige "pvl.nc"-formatet.
1. Kjør verktøyet drishtiimport.exe, som du finner i installasjonsmappen drishti: Filer | Last inn | Filer | Velg "Gråtone TIFF-bildefiler, og last inn en enkanals 3D-stakk, som lagret fra Fiji / ImageJ. Når det gjelder en sammensatt flerkanalsstakk, deler du kanalene i Fiji/ImageJ og lagrer hver enkelt. Voxel-typen er "ushort"; "Fil"..."Lagre som"..."TIF", svar "y" på alle spørsmål. I tilleggsinformasjonsvinduet som ber om voxelstørrelse, må du sørge for å legge til de riktige "X Y Z" voxel-størrelsene.
2. Laste inn *.pvl.nc filer i Drishti og gjengi: I hovedvinduet i Drishti, File | Last inn | Last inn 1 ( - 4 ) volumer avhengig av antall kanaler som er tilgjengelige (som separate filer). Når du har lastet inn, trykker du F2 for å få gjengivelse av høy kvalitet. Denne handlingen krever et kraftig GPU-kort. Informasjon for å håndtere gjengivelsesparametrene, Transfer function editor, søk på online tutorials. Når gjengivelsesegenskapene er fornøyd, fortsetter du med å generere en animert gjengivelse.
3. Gå til Vis og aktiver Redigeringsprogrammet for nøkkelbilder. Håndter embryoet og plasser det i ønsket startposisjon. Bruk høyre museknapp til å "dra" embryoet til midten om nødvendig, eller musen ruller for å zoome. Trykk på angi nøkkelbilde i Keyframe-redigeringsprogrammet, velg deretter en annen posisjon, vinkel eller zoom, dra tidslinjemarkøren til et annet tidspunkt og Angi nøkkelbilde på nytt. Nå er det 2 nøkkelbilder der embryoet er representert i 2 forskjellige posisjoner / vinkler / zoom, og en rekke rammer i mellom. Ved å trykke på Play-knappen kan Drishti interpolere de manglende forholdene og spille den av som en animasjon. Gå til Fil | Lagre bildesekvens for å lagre den animerte sekvensen for alle delbilder. Denne rammesekvensen kan senere åpnes i Fiji/ImageJ og lagres som AVI (File | Importere | Bildesekvens ... Fil | Lagre som | JPEG-komprimering med en rimelig bildefrekvens (vi foreslår 15 - 30).
  MERK: Selv om Drishti tillater lagring av * .wmv videoer, anbefales det å i stedet lagre som separate rammer og først senere konvertere serien til AVI- eller MOV-videoformat (dette kan gjøres ved hjelp av Fiji / ImageJ).
3D-rekonstitueringer og manuell segmentering av vev ved bruk av Amira
MERK: Denne kommersielle programvaren tillater, manuell eller automatisk/ halvautomatisk, 3D-segmentering av embryonalt vev i 3D-datasett. Det er et online "Learning Center" for denne programvaren med flere opplæringsprogrammer tilgjengelig ⁴¹. Nedenfor beskrives de grunnleggende trinnene som kreves for å segmentere embryonalt vev manuelt fra immunfluorescensfargede embryoer (trinn 1.2). Manuell segmentering er mye enklere etter at embryoet er riktig plassert i en standard A-P/D-V-akse (se avsnittet Forhåndsbehandling av bildedatasett, trinn 4.3).
1. Last inn et 3D TIFF-datasett. Sørg for å spesifisere de riktige voxel-dimensjonene når du blir spurt. Opprett og koble til en visualiseringsmodul (f.eks. "Orthoslice" eller "Volren") og inspiser datasettet i 3D.
2. Koble label-feltet (eller Rediger nytt etikettfelt i nyere versjoner av Amira). I denne programvaren lagres resultater av manuell segmentering i "materialer", så lag ett materiale for hvert vev av interesse. Bruk "lasso"-verktøyet for manuell segmentering. Det er flere opplæringsprogrammer tilgjengelig som forklarer hvordan du utfører dette (søk på nettet etter "Amira Segmentation Editor tutorial").
3. Når du er ferdig med segmentering av alle interessevev, avslutter du segmenteringsredigering ved å gå tilbake til prosjektmodus . Etter å ha opprettet en ny versjon av datasettet (etikettfeltet, som nå er knyttet til den opprinnelige datasettmodulen), der piksler som tilhører hvert materiale, har samme verdi.
4. Konverter disse "materialene" til 3D-objekter ved å generere 3D-overflatemodeller fra datasettet Etiketter. Dette kan gjøres ved å feste en "Generer overflate" -modul, justere parametere etter behov (aktiver alternativene "compactify", "border", "Adjust coords" og "Unconstrained Smoothing"). Klikk på Bruk og en ny modul *.surf genereres.
5. Visualisere overflateobjektene, trekke ut og eksportere individuelt som *obj-filer. Knytte til en skjerm | SurfaceView-modulen til *.surf-modulen, og inspiser i hovedviseren. I "egenskaper" -panelet i "SurfaceView" -modulen velger du Alle + Alle i "Materialer" -egenskapen, og klikker fjern, slik at betrakterens buffer tømmes. Deretter velger du bare ett materiale i den andre nedtrekket av Material-egenskapen , og klikker Legg til i bufferen. bare det materialet skal være synlig.
6. I egenskapen Tegn stil klikk i flere alternativer | opprette overflate og en ny *.surf-modul opprettes og legges til i prosjektet. Endre navnet på vevet (trykk F2 på tastaturet) og Fil | Eksporter data som... og Filtype: Wavefront (*.obj). Gjenta operasjonen for hvert materiale.
  MERK: Disse *.obj filer, hver inneholder en av vevene segmentert i Amira, kan brukes av andre verktøy ("3Dviewer" plugin fra Fiji / ImageJ og SimLab).
Interaktiv 3D-visualisering i et bærbart dokumentformat (PDF) ved hjelp av SimLab Composer
MERK: Denne 3D Computer Graphics-programvaren letter etableringen av overflategjengivelsesbilder, animasjoner og simuleringer. Nyttige opplæringsprogrammer finner du på linje ⁴². Her beskriver vi hvordan denne programvaren muliggjør opprettelse av 3D PDF interaktive illustrasjoner, ved hjelp av wavefront (*.obj) 3D overflatefiler opprettet med Amira (Trinn 2.3; Delen "3D-gjengivelse, visualisering og analyse").
1. Gå til Fil | Ny og lag en tom scene. Deretter fil | importere og importere første *.obj filen lagret fra Amira. Hold alle alternativene i importfilvinduet uten å klikke, og klikk OK.
2. Hvis ingenting vises i komponistens visningsvindu, klikker du CTRL+F eller ikonet for å tilpasse alle. Nå skal det segmenterte objektet vises midt i vinduet. Gjenta prosessen for å legge til et annet segmentert objekt og bekrefte plasseringen i forhold til den første (for eksempel 2 tilstøtende somitter).
3. Velg ett av objektene i visningsvinduet ved å klikke med venstre museknapp, endre navnet for å gjenspeile navnet på den anatomiske strukturen eller vevet, bytt deretter til representasjonen "3DGeom~1", og bruk Materialer-panelet til å endre fargen ved å endre R-, G,B-verdiene.
4. Gjenta dette for alle objekter til 3D-illustrasjonen er fullstendig montert. Vær oppmerksom på at noen materialer også kan gjøres gjennomsiktige ved å manipulere "Alpha" -kanalen, ved siden av RGB-verdiene, og dermed tillate observasjon av interne eller okkluderte objekter.
5. Med denne programvaren kan den monterte embryoillustrasjonen eksporteres som en "3D PDF" -fil, som kan inkluderes i publikasjoner. Først oppretter du en "mal" med tekst og aktive koblinger for å endre "Scenetilstander" for å kunne inkludere instruksjoner og tre forskjellige trinn i samme illustrasjon. Dette kan gjøres ved å bytte fra "Scenebuilding" til "Sharing" -modus (knapper til venstre for Komponist-vinduet), deretter klikke i Vis PDF-innstillinger og opprette en ny sidemal. Hvis du vil opprette en enkel interaktiv figur som skal inkluderes i et manuskript, bruker du ikke en mal og eksporterer ganske enkelt PDF.
  MERK: Bruk Adobe Acrobat Reader-programvare til å samhandle med 3D PDF-filene (operaabiliteten til funksjonene i den interaktive 3D PDF-illustrasjonen kan variere avhengig av hvilke versjoner av Acrobat Reader som er tilgjengelige). De fleste andre seere er ikke kompatible med 3D PDF-formatet, inkludert nettlesere. Slike interaktive 3D PDF-illustrasjoner kan inkluderes i publikasjoner; spør redaktører om denne muligheten på forhånd.
3D-visualisering og analyse ved hjelp av Imaris
MERK: Denne programvaren tillater omfattende bildevisualisering, analyse og tolkning av 2D-4D mikroskopi datasett, med intuitivt grensesnitt og arbeidsflyter. Det er flere nyttige opplæringsprogrammer på nettet om hvordan du kommer i gang med denne programvaren, tilgjengelig på nettstedet (https://imaris.oxinst.com/tutorials). For å laste inn og samhandle mer effektivt med store datasett i Imaris (vanligvis de som er større enn GPU-minnet), anbefales det å konvertere datasettet først til "*.ims", ved hjelp av "ImarisFileConverter.exe" -programmet som er installert i Imaris installasjonsmappe. ImarisFileConverter kan lese mange mikroskopi bildeformater, inkludert OME og "h5" filer som lagret av Fijis BigDataViewer.
1. 3D-visualisering
  1. Denne programvaren kan gjengi en 3D-visualisering av datasettet ved hjelp av "3D View" -modus, og brukeren kan gjøre flere justeringer i hvordan datasettet vises [f.eks. velge mellom MIP (Maximum intensity Projection) eller blandingsmodus (bedre gjengivelse med dybdesignaler og skygger)].
  2. Ortogonal visninger" modus - Med riktig embryo posisjonering (Trinn 4.3; "Bildedatasett forbehandling" -delen) man kan bruke "Seksjon" -fanen og navigere gjennom hele embryoet og se optiske seksjoner fra de normale planene (tverrgående, coronal og sagittal). Hvis embryoer ikke er riktig omplassert, er det ekstremt vanskelig å tolke anatomien med ortogonale plan (se supplerende figur 3). Selv om Imaris har en funksjon kjent som "referanseramme" for å omgå dette problemet når du analyserer 3D-embryoer, er det å foretrekke å omplassere datasettene a priori.
2. 3D-analyse
  MERK: Denne programvaren har også flere verktøy for å analysere morfologi og fluorescensintensiteter. Som et eksempel beskriver vi en enkel arbeidsflyt for å analysere vevsfluorescensintensitetsvariasjoner over tid ved hjelp av Imaris "Spots" -verktøyet, der brukeren manuelt plasserer sfæriske interesseområder (ROIer) i embryoet i 3D, og Imaris kan deretter måle vevsfluorescensen inne i disse sfæriske ROIene.
  1. Last inn et 3D- eller 4D-datasett i Imaris, og legg til et nytt sted i 3D-visningsmodus . Deretter kan man velge bestemte punkter i embryoet (også i løpet av flere tidspunkter hvis man bruker et 4D-datasett) og kvantifisere inne i disse flekkene, for eksempel intensitetsgjennomsnittet.
    MERK: Denne programvaren tillater også plotting av intensiteten over tid. Dette gjør at brukeren enkelt kan svare på spørsmål som: "Hvordan endres fluorescensen inne i en somite over tid?".
  2. Legg til spotmodulen ved å klikke på Legg til nytt sted-knappen eller velge 3D-visning | Steder i Imaris meny. Velg Hopp over automatisk reaksjon, rediger manuelt. Bytt Imaris-pekermodus fra Naviger til Velg (dette kan også gjøres ved å trykke på ESC-tasten på tastaturet).
  3. I egenskaper-vinduet for Spots velger du den spesifikke kanalen som stedet skal festes til (f.eks. "Kanal 1"), og aktiverer automatisk tilkobling til valgt sted i manuell sporing og aktiver forsinkelse før automatisk fremrykking.
  4. Flytt musepekeren til visualiseringsvinduet, og markøren skal endres til en hul gul trådsfære. Gå til tidspunkt 1 og legg til et sted (=sfære) ved å klikke i vevet av interesse. Sfæren ("Spot") legges bare til hvis du klikker mens du holder nede SKIFT-tasten . Gjenta for alle ønskede tidspunkter, sørg for å spore den samme delen av vevet over tid.
  5. Bytt til kategorien Statistikk i vinduet Egenskaper for Spotfarger, og gå fra Samlet til Detaljert statistikk i Statistikk-vinduet. Fra den første rullegardinmenyen velger du Bestemte verdier, og fra den andre rullegardinmenyen velger du "Intensitetsgjennomsnitt Ch =*...", der Ch* er kanalen der målingen skal utføres. En knapp rett til "Klikk for å åpne tidstegningspanelet" finner du nederst til venstre i vinduet for flekkegenskaper. Ved å klikke på denne knappen åpnes et plott med median fluorescensintensitet inne i "flekkene", plottet over tid. Disse verdiene kan også eksporteres til et regneark for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultatene vist i dette papiret for både levende og immunfluorescence imaging, ble oppnådd ved hjelp av et to-foton system, med en 20 × 1.0 NA vann mål, eksitasjon laser innstilt til 960 nm, og GaAsP fotodetektorer (som beskrevet i Dias et al. (2020)⁴³. Optisk projeksjonstomografi ble gjort ved hjelp av en spesialbygd OPenT-skanner (som beskrevet i Gualda et al. (2013)²⁸.

Levende bildebehandling (4D-analyse)
En representativ analyse av LuVeLu reporteraktivitet i museembryoer under aksial forlengelse, oppnådd i henhold til de beskrevne protokollene for "Prøvepreparering for levende avbildning" (Trinn 1.1; Delen "Eksempelforberedelse for 3D-avbildning"), "Direkte bildebehandling av datasett" (trinn 3; "Bildedatasett forhåndsbehandling" og "3D-visualisering og analyse ved hjelp av Imaris" (trinn 4.4; "3D-gjengivelse, visualisering og analyse") kan observeres i figur 1 og video 1.

3D-visualisering og analyse
Et representativt resultat for bruk av immunfluorescensanalyser for å oppdage potensielle NMPer og nøkkelregulatorer for mesodermdifferensiering, oppnådd etter protokollene beskrevet for "Prøvepreparering for immunfluorescensmikroskopi" ("Prøvepreparering for 3D- og 4D-avbildning" seksjon, trinn 1.2), "Dekonvolusjon" og "Immunofluorescence imaging dataset pre-processing" ("Forhåndsbehandling av bildedatasett", henholdsvis trinn 3.2 og 3.4) og "3D-visualisering og analyse ved hjelp av Imaris" ("3D-gjengivelse, visualisering og analyse", trinn 4.4) kan observeres i figur 2.

3D-gjengivelse av immunfluorescensfarginger
Video 2 viser et representativt resultat for en immunfluorescensanalyse for å oppdage potensielle NMPer oppnådd i henhold til de beskrevne protokollene for "Prøvepreparering for immunfluorescensmikroskopi" (Trinn 1.2; "Prøvepreparering for 3D- og 4D-avbildning"-delen), delen "Dekonvolusjon" og "Immunofluorescence imaging dataset pre-processing" (henholdsvis trinn 3.2 og 3.4; "Bildedatasett forhåndsbehandling" og delen "3D-gjengivelse og visualisering ved hjelp av Drishti" (trinn 4.1; Delen "3D-gjengivelse, visualisering og analyse").

3D-rekonstruksjoner
Video 3 ble generert etter de beskrevne metodene for "Prøvepreparering for immunfluorescensmikroskopi" (Trinn 1.2; "Eksempelforberedelse for 3D- og 4D-avbildning"-delen), "Immunofluorescence imaging dataset pre-processing" (Trinn 3.4; "Image dataset pre-processing" seksjon), og "3D rekonstruksjoner og manuell segmentering av vev ved hjelp av Amira" (Trinn 4.2; "3D-gjengivelse, visualisering og analyse"). Det viser en 3D-rekonstruksjon, basert på immunfluorescensfarging, av kaudale vev av en E9.5 vill type (WT) museembryo.

Interaktive 3D-illustrasjoner
I figur 3 presenterer vi en interaktiv 3D-visualisering av en rekonstruksjon av kadale vev av museembryoer i et bærbart dokumentformat (3D PDF), utarbeidet etter de beskrevne protokollene for "Prøvepreparering for immunfluorescensmikroskopi" (Trinn 1.2; "Eksempelforberedelse for 3D- og 4D-avbildning"-delen), "Immunofluorescence imaging dataset pre-processing" (Trinn 3.4; "Forhåndsbehandling av bildedatasett"), "3D-rekonstruksjoner og manuell segmentering av vev ved hjelp av Amira" og "Interaktiv 3D-visualisering i et bærbart dokumentformat (PDF) ved hjelp av SimLab" ("3D-gjengivelse, visualisering og analyse", henholdsvis trinn 4.2 og 4.3). Denne typen format kan enkelt brukes til å legge til rette for å formidle vitenskapelig innhold til et mer generelt publikum, spesielt i et undervisningsmiljø. Interaktiv visualisering krever bruk av Adobe Acrobat Reader (tillat 3D-plugin).

Visualisering av OPT-datasett
Video 4 viser et representativt eksempel på et OPT-rekonstruert datasett, etter å ha avbildet et E18.5-musefetistre. Prøven ble utarbeidet som beskrevet i protokoller for delen "Prøvepreparering for optisk projeksjonstomografi" ("Prøvepreparering for 3D- og 4D-avbildning"; Trinn 1.3) "OPT-datasett forbehandling og rekonstruksjon" (trinn 3.5) og forskjellige moduler av "3D-gjengivelse, visualisering og analyse" (trinn 4). En detaljert anatomisk analyse (f.eks. målinger) kan også utføres i dette datasettet ved hjelp av Fiji/ImageJ, Amira eller Imaris-programvaren. Filmen inneholder fire videosegmenter: den første viser en sekvens av svarte og hvite skyttene produsert med Fiji / ImageJ; den andre, ortogonale visninger produsert med Imaris som viser interaktiv 3D-kutting og gjengivelse av ortogonale vevsdeler; den tredje viser fosteret "montering" fra fargede skyttene, som tilberedt i Amira; Det siste videosegmentet viser en animasjon av fosteret i 3D fra forskjellige visninger, utarbeidet med Drishti.

Video 1 -To-foton live bilde av LuVeLu reporter uttrykk i Snai1-cKO og kontrollere E8.5 embryoer (tilpasset fra ref. 43). De første segmentene viser reporteraktiviteten om gangen = 0 (z-stabel med trinnstørrelse på 5 μm) og de andre delene inneholder full levende bildebehandling (10 μm z-stabler hver 8,5 min). Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2 - 3D-gjengivelse av en helmontert immunfluorescensfarging for T (Brachyury) og Sox2 av en E10.5 wild type tailbud. T-uttrykket vises i magenta, Sox2 i gult og DAPI i grått. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3 - 3D rekonstruksjon av kaudal del av en sen E9.5 vill type mus embryo, med fokus på konturering av ulike kaudale vev inkludert mesoderm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4 - E18.5 wild type embryo som avbildet med optisk projeksjon tomografi, fremhever into avbildning og flere teknikker for visualisering og gjengivelse av 3D-datasett. Det første segmentet viser en sekvens av sagittale skiver utarbeidet i Fiji / ImageJ, den andre "levende" ortogonale utsikten som gjengitt i Imaris, den tredje en sekvensiell gjengivelse fra fargede skytten skiver utarbeidet i Amira, og den fjerde en animert gjengivelse utarbeidet i Drishti. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Figur 1: 4D-analyse av LuVeLu reporteruttrykk i E8.5 Snai1-cKO og kontrollembryoer (tilpasset fra ref. 43). (A) Øyeblikksbilde på tidspunkt = 0 av LuVeLu-reporteren , i Snai1-cKO(Meox2-Cre^+/0::Snai1^flox/-) (Aa) og kontroll (Ab) embryoer. I tillegg til det normale LuVeLu-signalet i det presomitiske mesodermet, viser Snai1-cKO-embryoer også LuVeLu-uttrykk i den ektopiske bulen som oppstår fra den primitive streken (hvite piler). (B) Snai1-cKO::LuVeLu^+/0 temporal intensitet gjennomsnittlig kvantitativ analyse i regionen fremhevet av den røde flekken (Ba) indikerer eksistensen av to topper (ved t = 1,3 t og t = 3,6 h av tidsforløpet) og en betydelig nedgang mellom dem, noe som derfor tyder på sykkelaktivitet i bulen av det betingede mutantembryoet. Ingen tegn til LuVeLu sykkelaktivitet ble observert i nærheten av den primitive streken (grønt sted; bb) i LuVeLu^+/0 kontrollembryoer. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Helmontert immunhistokjemi i E9,5 Snai1-cKO- og WT-embryoer (tilpasset fra ref. 43). (B) Immunostainings for Tbx6 (grønn) og Lam1 (rød). DAPI vises i blått. 3D-gjengivelse (blandingsmodus) av kaudaldelen av de forskjellige embryoene (Aa, Ab, Ba og Bb). Tverrgående (Aa1, Ab1, Ba1, Ba2, Bb1 og Bb2) og sagittal (Aa2, Ab2, Ba3 og Bb3) optiske seksjoner sammen med forstørrelser (Mag.) vises også for de forskjellige embryoene. Forstørrelser vises uten DAPI. Hvite piler fremhever forskjeller i plasseringen av noen NMPer (T og Sox2 dobbeltpositive celler) i mutantembryoene. Gule piler og pilspisser peker på henholdsvis ektopisk/unormalt Tbx6- og Lam1-uttrykk i Snai1-cKO-embryoene. Skalastenger tilsvarer 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 - 3D PDF - Interaktiv 3D-illustrasjon i 3D PDF-format som viser 3D-rekonstruksjoner av segmentert kaudalt vev av wildtype museembryoer under aksial forlengelse (E8.5, E9.5 og E10.5). Segmentering ble gjort manuelt i Amira, og 3D PDF ble samlet og eksportert i Simlab Composer. Interaktiv visualisering krever Adobe Acrobat Reader (tillat 3D-plugin-modulen). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 1 - Representativt resultat av et bleket embryo (etter trinn 3.2; "Eksempelforberedelse for 3D- og 4D-avbildning"-delen). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2 - Representativt resultat av Z-dybdesignaldemping (trinn 4.1; Delen "Forhåndsbehandling av bildedatasett"). A - før Z-dybde signaldemping; B - god Z-dybde signaldemping; C - feil Z-dybdesignaldemping. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3 - Representativt resultat av en helmontert immunfluorescensfarging som viser og E7.5 museembryo som har blitt omplassert (A) etter "Reposisjonering av embryo til en anatomisk standardposisjon ved hjelp av Fiji / ImageJ" (Trinn 3.4.3; "Bildedatasett forbehandling" seksjon) versus samme embryo uten å bli omplassert (B). Visualisering ble oppnådd ved hjelp av Imaris (se trinn 4.1.2; Delen "3D-gjengivelse, visualisering og analyse"). T i gult, Sox2 i magenta og DAPI i blått. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aksial forlengelse og segmentering er to av de mest komplekse og dynamiske prosessene som oppstår under virveldyr embryonal utvikling. Bruk av 3D- og 4D-avbildning med encellet sporing har i noen tid blitt brukt til å studere disse prosessene i både sebrafisk og kyllingembryoer, der tilgjengelighet og kulturforhold letter komplekse^avbildninger 19,44,45,46,47,48,49 . I motsetning til dette forblir midt- og senorganogenesestadiene av museembryoet dårlig studert i slike detaljer, selv om det er gjort noen fremskritt, for eksempel ved intravital avbildning⁵⁰. I dette manuskriptet tilbyr vi spesifikke protokoller for flere metoder som kan brukes til oppkjøp av flerdimensjonale bilder og deres analyse for å lette studiet av NMP-er og deres mesodermderivater under nakke-, trunk- og haledannelse. Selv om disse protokollene ble designet for museembryoer, kan de enkelt justeres for å fungere for explant-systemer og in vitro-modeller som 3D embryonale stamcelleaggregater som gastruloider^51,52. Faktisk, hvis det brukes på menneskelige gastruloider⁵³, vil disse metodene legge til rette for en bedre in toto avbildning og dataanalyse av menneskelig aksial forlengelse og segmentering, spesielt gitt kompatibiliteten til disse in vitro-modellsystemene med langsiktig 4D levende avbildning. I tillegg til disse protokollene gir vi også generell informasjon om ulike tilgjengelige mikroskopiteknikker og hvordan de kan brukes til å passe til spesifikke eksperimentelle mål. Vi håper denne informasjonen hjelper forskere med å forbedre sine eksperimentelle design og dra full nytte av mikroskopiutstyret og bildeanalyseverktøyene som er tilgjengelige i laboratoriene og institusjonene.

Prøvepreparering er et av de viktigste trinnene i protokollene som er beskrevet i dette manuskriptet, da riktig bevaring og behandling av embryoet under hele prosedyren, fra disseksjon til montering i mikroskopet, er avgjørende for å skaffe data av høy kvalitet. Dehydrering (og rehydrering), bleking og rydding av prosedyrer er de mest kritiske trinnene under prøvepreparering, og påvirker sterkt det endelige resultatet av avbildningen. Derfor har vi detaljert disse trinnene i vår protokoll og gitt tips som vil hjelpe forskere med å oppnå en plettfri forberedelse av prøvene sine. Spesielt har vi detaljert bruken av tre forskjellige løsninger for rydding av postimplantasjonsmusembryoer (opp til E11.5). Selv om metylsilisylat og BABB har blitt brukt i flere år og er effektive ryddingsreagenser, er fullstendig laserinntrengning i noen vev, spesielt mesoderm, noen ganger vanskelig å oppnå. På den annen side ble RapiClear funnet å være svært effektiv i å rydde museembryoer på disse utviklingsstadiene. I våre hender viste det seg å muliggjøre fullstendig lasergjennomtighet i de ulike embryonale vevene, og siden det ikke er giftig og ikke krever embryodehydrering, forenkler det i stor grad nøkkeltrinnet for montering av embryoene i mikroskopisklie. For å overvinne nødvendigheten av å manipulere embryoene i lysbildet (ryddede embryoer blir svært skjøre og vanskelige å manipulere når de er gjennomsiktige) eller behovet for å ty til kommersiell programvare (f.eks. Amira eller Imaris), har vi gitt en enkel, men effektiv rørledning, ved hjelp av Fiji / ImageJ (gratis åpen kildekode-programvare), som gjør at embryo omplassering til en anatomisk standard / spesifikk posisjon under bildeforbehandling uten å miste datakvalitet. Derfor forventer vi metodene og detaljene vi gir i dette manuskriptet for å lette og bidra til å forbedre det viktigste trinnet i prøvepreparering under immunfluorescensanalyser.

Under bildeoppkjøp er det viktig å vurdere konfigurasjonen av systemet, noe som påvirker hvordan prøver må vedlikeholdes for levende bildebehandling eller monteres for optimal observasjon i 3D. For eksempel krever museembryoer en varmekilde, høye nivåer av O₂ og flytende næringsrike medier (ikke faste), noe som gjør det vanskeligere å holdes levende i et mikroskop med oppreist eller en konvensjonell lysarkkonfigurasjon. For riktig 3D-avbildning av embryoer er immobilisering også viktig. Tilgjengelig optikk er også en annen viktig faktor å vurdere; For riktig 3D-avbildning bør høye numeriske blendermål foretrekkes, men de er ikke alltid tilgjengelige, spesielt når det kreves store arbeidsavstander (mer enn noen få hundre mikrometer). Fysiologiske (dvs. "dyppe") linser er svært vanlige for levende avbildning, men disse er ikke ideelle for avbildning gjennom en glassbunnsfat eller for klare prøver montert på BABB eller metylsilisylat. Selv om mål optimalisert for ryddet vev blir vanligere, er de fortsatt relativt sjeldne å finne i de fleste laboratorier. Det er også mulig å avbilde ryddet vev med konvensjonelle mål, men brukerne må være klar over begrensningene og den nødvendige omsorgen før de tolker og analyserer datasettene, som vi forklarer i avsnittene ovenfor. Videre krever nøyaktig deteksjon og tolkning av bilderesultater alltid nøye valg, ikke bare av instrumentet, men også av driftsforholdene og innstillingen av parametere. Brukere oppfordres til å lese følgende anmeldelser 54,55,56,57 for å forstå prinsippene for riktig digital avbildning og tolkning av bioimages.

Immunfluorescens anvendt på (2D) histologiske seksjoner har vært kjennetegnet på studier som søker å forstå vev og celleorganisasjon inne i embryoer. Fremveksten av helmonterte immunisoleringsmetoder og ikke-destruktive 3D-avbildningsteknikker (som de som er beskrevet her) har gitt utviklingsbiologer midler til å undersøke vev og celle romlig organisering i intakte embryoer, hvor det er lettere og mer nøyaktig å forstå gen- og proteinuttrykk og deres forhold til morfogenetiske prosesser. Med i totoavbildning er det nå mulig å utføre virtuell histologi (virtuell seksjonering i vilkårlige skiver; Tilleggsfigur 3) og 3D-visualiserings- og analyseverktøyene kan enkelt brukes til å utforske ulike hypoteser om celle- og vevsarkitektur og kommunikasjon (se figur 2, video 2 og video 4). Tatt i betraktning at mange tidsskrifter (f.eks. eLife and Development) nå gir muligheten til å inkludere videoer i den elektroniske versjonen av avisen, oppfordrer vi forskere til å dra nytte av denne muligheten og ikke bare utføre 3D- og 4D-bildebehandlingseksperimenter og analyse, men også å lage 3D-videoer som fremhever resultatene. Denne viktige endringen i måten data presenteres og publiseres på, vil muliggjøre en bedre forståelse av resultatene fra forskerne og deres jevnaldrende. Til syvende og sist har disse metodene potensial til å forbedre vår forståelse av virveldyrsegmentering, spesielt når det gjelder NMPs rolle (Attardi et al. (2018)⁴⁵ og Dias et al. (2020)⁴³ er to gode eksempler).

I dette arbeidet har vi fremhevet hvordan bruken av noen programvareverktøy (f.eks. Amira og Imaris, men også gratis åpen kildekode-verktøy som Fiji / ImageJ og Drishti) tillater og forbedrer 3D-datavisualisering og analyse i sammenheng med virveldyraksialforlengelse og somitogenese. I de fleste tilfeller, som for flere bioinformatiske verktøy, kan programvaren som er beskrevet her potensielt erstattes av en annen (dvs. det er flere programvareløsninger og oppsigelser). Vi finner imidlertid at "3D View" -funksjonen i Imaris tillater en 3D-visualisering med mye bedre kvalitet enn den som er oppnådd ved hjelp av "3D Viewer" Fiji / ImageJ-plugin, slik at du for eksempel kan velge mellom MIP- eller blandingsmodus. I tillegg finner vi "Orthogonal Views" -funksjonen i Imaris og rørledningen for 3D-analyse og kvantifisering (f.eks. "Spot" -modulen) brukervennlig. I denne saken, selv om praktisk talt alle programvareverktøy tillater en eller annen form for 3D-gjengivelse, anbefaler vi Drishti på grunn av sin unike lysmodell og skyggelegging som muliggjør generering av svært realistiske gjengivelser (se siste segment av Video 4). Tommelfingerregelen for all bioinformatisk behandling av bildedatasett (forbehandling og 3D-gjengivelser) er at sluttresultatet må forbli en trofast representasjon av det som observeres i embryoet. Derfor har vi gitt enkle metoder for å redusere problemene som skapes av Z-aksens skaleringsforvrengning (på grunn av brytningsindekskonflikt) og dybdesignaldemping (forårsaket av lysspredning i dype prøver) som i stor grad påvirker kvaliteten og tolkningen av bildedatasettene. Ved hjelp av disse algoritmene ga vi instruksjoner for å manuelt segmentere og 3D rekonstruere mesodermalt vev fra helmonterte immunfluorescensfarginger, ved manuell konturering (ofte ikke mulig med verktøy for automatisert segmentering) ved hjelp av Amira-programvaren. Vi finner denne programvaren spesielt nyttig for manuell telling av vev der det ikke er noen klare fysiske separasjons- eller kontrastforskjeller mellom dem (f.eks. uttrykk for en bestemt transkripsjonsfaktor). Et ikke-kommersielt anbefalt alternativ for Amira, selv om det er mindre kraftig, er LabKIT Fiji / ImageJ-plugin (https://imagej.net/Labkit).

Vi har også inkludert blant de representative resultatene et eksempel på en 3D-visualisering av i toto E18.5 musefetistre avbildet med optisk projeksjonstomografi, som utvider mulighetene for optisk avbildning og 3D-bildeanalyse til hele musen embryogenese²². Disse metodene kan brukes til å forstå og analysere (f.eks. gjennom morfologiske målinger) skjelettavvik, som smeltet ryggvirvler, skoliose eller spondylokstal dysostose, som senere kan oppstå på grunn av problemer under somitogenese (f.eks. Lfng mutasjon)13,58,59,60,61,62 . Det er viktig at denne bildemetoden tillater observasjon av skjelett misdannelser i en global sammenheng, inkludert andre vev (f.eks. muskler) som også kan bidra til fenotypene som påvirker vertebrale kolonne⁶³.

Til slutt, og i samsvar med nyere arbeid som fremhever volumetriske modeller laget med bildedatasett fra eMouse Atlas Project⁶⁴, har vi beskrevet en detaljert trinnvis metode som kan brukes både til å illustrere kraften i 3D-modeller (f.eks. 3D PDF) til et mer generelt publikum og for å hjelpe til med studiet og undervisningen av virveldyraksial forlengelse og segmentering. Vi håper informasjonen som presenteres i dette manuskriptet bidrar til å endre måten forskere designer, analyserer og presenterer sine eksperimenter på, og for å forbedre vår kunnskap om virveldyr kroppsaksedannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi vil takke Olivier Pourquié og Alexander Aulehla for LuVeLu-reporterstammen, SunJin-laboratoriet for RapiClear-testprøven, Hugo Pereira for hjelpen med å bruke BigStitcher, Nuno Granjeiro for å bidra til å sette opp live bildeapparatet, IGC-dyreanlegget og tidligere og nåværende medlemmer av Mallo-laboratoriet for nyttige kommentarer og støtte i løpet av dette arbeidet.

Vi takker den tekniske støtten til IGCs Advanced Imaging Facility, som støttes av portugisisk finansiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 og ref # PTDC / BII-BTI / 32375 / 2017, finansiert av Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), i henhold til partnerskapsavtalen for Portugal 2020, gjennom European Regional Development Fund (FEDER) og Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av tilskudd LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) og SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) til M.M., forskningsinfrastrukturen Congento, prosjekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170, og PhD fellowship PD/BD/128426/2017 til A.D.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133 (2009).
Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042 (2016).
Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524 (2020).
Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97 (2018).
Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644 (2018).
Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429 (2009).
Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086 (2014).
Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060 (2012).
Thermofisher.com. , Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020).
Simlab-soft.com. , Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020).
Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615 (2020).
Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611 (2020).
Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586 (2020).
Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252 (2015).
Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
Jost, A. P. -T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996 (2009).
Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991 (2020).

Developmental Biology

Tre og firedimensjonale visualiserings- og analysetilnærminger for å studere vertebrataksial forlengelse og segmentering

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Utviklingsstadium	Anbefalt fikseringstid (PFA 4 %)
E7.5	1t30
E8.5	2t
E9.5	3t
E10.5	4t
E11.5	4t

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.