Funktionell bedömning av intestinal permeabilitet och neutrofil transepithelial migration hos möss med hjälp av en standardiserad tarmslinga modell
Summary
Dysregulerad intestinal epitelbarriärfunktion och immunsvar är kännetecken för inflammatorisk tarmsjukdom som fortfarande är dåligt undersökt på grund av brist på fysiologiska modeller. Här beskriver vi en mus intestinal loop modell som använder en väl-vascularized och exteriorized tarm segment för att studera mucosal permeabilitet och leukocyte rekrytering in vivo.
Abstract
Tarmslemhinnan kantas av ett enda lager epitelceller som bildar en dynamisk barriär som möjliggör paracellulär transport av näringsämnen och vatten samtidigt som man förhindrar passage av luminalbakterier och exogena ämnen. Ett brott mot detta lager resulterar i ökad permeabilitet till luminalt innehåll och rekrytering av immunceller, som båda är kännetecken för patologiska tillstånd i tarmen inklusive inflammatorisk tarmsjukdom (IBD).
Mekanismer som reglerar epitelbarriärfunktionen och transepithelial migration (TEpM) av polymorfonukleära neutrofiler (PMN) förstås ofullständigt på grund av bristen på experimentella in vivo-metoder som möjliggör kvantitativa analyser. Här beskriver vi en robust murin experimentell modell som använder ett exteriorized intestinala segment av antingen ileum eller proximal kolon. Den exterioriserade intestinala slingan (iLoop) är helt vascularized och erbjuder fysiologiska fördelar jämfört med ex vivo kammaren-baserade metoder som ofta används för att studera permeabilitet och PMN migration över epitelial cell monolayers.
Vi visar två tillämpningar av denna modell i detalj: (1) kvantitativ mätning av intestinala permeabilitet genom påvisande av fluorescens-märkta dextrans i serum efter intraluminal injektion, (2) kvantitativ bedömning av migrerade PMN över intestinala epitel i tarm lumen efter intraluminal införandet av chemoattractants. Vi visar genomförbarhet av denna modell och ger resultat med hjälp av iLoop hos möss som saknar epitelial tight junction-associerade protein JAM-A jämfört med kontroller. JAM-A har visat sig reglera epitelbarriärfunktionen samt PMN TEpM under inflammatoriska svar. Våra resultat med hjälp av iLoop bekräftar tidigare studier och belyser vikten av JAM-A vid reglering av intestinal permeabilitet och PMN TEpM in vivo under homeostas och sjukdom.
iLoop-modellen ger en mycket standardiserad metod för reproducerbara in vivo-studier av intestinal homeostas och inflammation och kommer avsevärt att öka förståelsen för tarmbarriärfunktion och slemhinnainflammation hos sjukdomar som IBD.
Introduction
Intestinala slemhinnan omfattar ett enda lager av kolumnära intestinala epitelceller (IECs), underliggande lamina propria immunceller och muscularis slemhinnan. Förutom sin roll i absorptionen av näringsämnen är tarmepiteleriet en fysisk barriär som skyddar kroppens inre från luminal kommensala bakterier, patogener och dietantigener. Dessutom samordnar IECs och lamina propria immunceller immunsvaret inducera antingen tolerans eller svar beroende på sammanhanget och stimuli. Det har rapporterats att störningen av epitelbarriären kan föregå uppkomsten av patologisk mukosal inflammation och bidra till inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) som omfattar både ulcerös kolit och Crohns sjukdom1,2,3,4,5,6,7. Individer med ulcerös kolit presenterar överdriven transepithelial migration (TEpM) av polymorfokonukleära neutrofiler (PMN) bildar kryptabscesser, ett fynd som har associerats med svårighetsgraden av sjukdom8,9. Även om komprometterad epitelial barriär funktion och överdriven immun svar är kännetecken för IBD, finns det en brist på experimentella in vivo analyser för att utföra kvantitativa bedömningar av intestinala permeabilitet och immun cell rekrytering till intestinala slemhinnan.
De vanligaste metoderna som används för att studera intestinal epitelpermeabilitet och PMN TEpM använder ex vivo-kammarbaserade metoder med IEC-monoskikt odlade på halvgenomsläppliga porösamembraninsatser 10,11,12. Epitelbarriärens integritet övervakas antingen genom mätningar av transepithelial elektrisk resistans (TEER) eller det paracellulära flödet av Fluorescein isothiocyanate (FITC)-märkt dextran från apical till basal fack13,14,15. På samma sätt studeras PMN TEpM vanligtvis som svar på en kemoattraktiv som tillsätts i den nedre kammaren16. PMN placeras i den övre kammaren och efter en inkubationsperiod samlas PMN som har migrerat in i basalfacket och kvantifieras. Även om dessa metoder är användbara, lätta att utföra och mycket reproducerbara, är de uppenbarligen reduktionistiska metoder och utgör inte nödvändigtvis en korrekt återspegling av in vivo-förhållanden.
Hos möss är en vanlig analys för att studera intestinal paracellulär permeabilitet genom oral sondmatning av FITC- dextran och efterföljande mätning av FITC-dextran utseende i blodserum13,17. Nackdelen med denna analys är att det representerar en bedömning av den totala barriärintegriteten i mag-tarmkanalen snarare än den för regionala tarmbidrag. Dessutom används Evans blå ofta för att utvärdera vaskulär läckage in vivo18 och har också använts för att utvärdera intestinala slemhinnor permeabilitet i mus och råtta19,20,21. Kvantifieringen av Evans blå i tarmslemhinnan kräver extraktion från vävnad som använder inkubation i formamid över natten. Därför kan samma vävnad inte användas för att studera intestinal epitelpermeabilitet och neutrofiltration.
Här lyfter vi fram ett enkelt protokoll som minskar antalet djur som behövs för att samla in reproducerbara data om colonic mucosal permeability och leukocyte transepithelial migration in vivo. Vi rekommenderar därför användning av FITC-dextrans som är lätta att upptäcka i blodserum utan att äventyra integriteten hos tarmslingor som kan skördas för vidare analys. Observera att tarmligated slingor har använts i olika arter (inklusive mus, råtta, kanin, kalv) för att studera bakteriell infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes och Escherichia coli)22,23,24,25 samt intestinal permeabilitet26; Men så gott vi vet finns det inga studier som undersöker mekanismer för PMN TEpM i specifika regioner i tarmarna såsom ileum eller kolon som vanligtvis är involverade i IBD.
Här beskriver vi musens tarmslinga (iLoop) som är en robust och pålitlig mikrokirurgisk in vivo-metod som använder ett välvaskulärt och exteriöriserat tarmsegment av antingen ileum eller proximal kolon. ILoop-modellen är fysiologiskt relevant och möjliggör bedömning av tarmbarriärintegritet och PMN TEpM på levande möss under anestesi. Vi visar två tillämpningar: 1) kvantifiering av serum nivåer av 4 kDa FITC-dextran efter intraluminal administrering i iLoop 2) kvantifiering av transmigrerade PMN i iLoop lumen efter intraluminal injektion av potent chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Dessutom använder iLoop-modellen med Jam-a-nullmöss eller möss som hyser selektiv förlust av JAM-A på IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) jämfört med kontrollmöss, vi kan bekräfta tidigare studier som har rapporterat ett stort bidrag för tätt knutpunkts-associerade protein JAM-A till intestinal permeabilitet och neutrofiltransmigration15,28,29,30,31.
ILoop-modellen är en mycket funktionell och fysiologisk metod som kan användas för att bekräfta in vitro-analyser. Dessutom är detta en mångsidig experimentell modell som gör det möjligt att studera olika reagenser som kan injiceras i slinglumen, inklusive kemokiner, cytokiner, bakteriella patogener, toxiner, antikroppar och terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mekanismer som ansvarar för dysregulation av intestinala barriär funktion och immun cell rekrytering under patologiskt villkor såsom IBD är ofullständigt förstås. Här beskriver vi en robust in vivo murinmodell som använder ett välvaskulärt exteriöriserat tarmsegment av antingen ileum eller proximal kolon och möjliggör bedömning av intestinal permeabilitet, neutrofila migrationsstudier samt andra applikationer.
ILoop är en icke-återhämtningsoperation som utförs på levande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Sven Flemming vid Universitetet i Wuerzburg för hans bidrag till inrättandet av den proximala kolonslingmodellen, Sean Watson för förvaltningen av muskolonierna och Chithra K. Muraleedharan för att hjälpa till med förvärvet av bilderna av iLoop-modellen. Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen/DFG (BO 5776/2-1) till KB, R01DK079392, R01DK072564 och R01DK061379 till C.A.P.
Materials
| Equipment and Material | |||
| BD Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" | BD | 305122 | |
| BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" | BD | 305106 | |
| BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle | BD | 309659 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Corning | 14-959-53A | |
| Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate | FisherScientific | 07-200-592 | |
| Corning Non-treated Culture Dish, 10cm | MilliporeSigma | CLS430588 | |
| Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile | FisherScientific | 25806 2WC | |
| Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" | Medex | 3249-1 | |
| EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Falcon Centrifuge Tube 50ml | VWR | 21008-940 | |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | FisherScientific | 15-901-10R | |
| Halsey Needle Holder (needle holder) | FST | 12001-13 | |
| Kimwipes, small (tissue wipe) | FisherScientific | 06-666 | |
| 1.7ml Microcentrifuge Tubes | Thomas Scientific | c2170 | |
| Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) | Sarstedt | 41.1501.105 | |
| Moria Fine Scissors | FST | 14370-22 | |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) | Falcon | 352235 | |
| Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant | Dechra | 12920060 | |
| Ring Forceps (blunt tissue forceps) | FST | 11103-09 | |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD | FisherScientific | NC9452680 | |
| Semken Forceps (anatomical forceps) | FST | 1108-13 | |
| Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting | HenrySchein | SS694 | |
| Student Fine Forceps, Angled | FST | 91110-10 | |
| 10ml Syringe PP/PE without needle | Millipore Sigma | Z248029 | |
| 96 Well Cell Culture Plate | Corning | 3799 | |
| Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm | Instech | FTP-20-30 | |
| Solutions and Buffers | |||
| Accugene 0.5M EDTA | Lonza | 51201 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Corning | 21-023-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) | BioLegend | 127610 | |
| CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) | ThermoFisher | 12-0112-81 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen | C36950 | |
| Dithiotreitol | FisherScientific | BP172-5 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | R&D Systems | 511550 | |
| Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 | Sigma | 60842-46-8 | |
| Isoflurane | Halocarbon | 12164-002-25 | |
| Leukotriene B4 | Millipore Sigma | 71160-24-2 | |
| PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) | BD Pharmingen | 557235 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) | BD Bioscience | 553142 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A |
References
- Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
- Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
- Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn’s disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
- Michielan, A., D’Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
- Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
- Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
- Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
- Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
- Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
- Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
- Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
- Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
- Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
- Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
- Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
- Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
- Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
- Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
- Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
- Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
- Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
- JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , e5024 (2020).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
- Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
- Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
- Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
- Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
- Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
- Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).
