Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة

Published: February 11, 2021 doi: 10.3791/62093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dysregulated وظيفة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابات المناعية هي السمات المميزة لمرض التهاب الأمعاء التي لا تزال سيئة التحقيق بسبب عدم وجود نماذج فسيولوجية. هنا، ونحن نصف نموذج حلقة الماوس المعوية التي توظف قطاع الأمعاء الأوعية الدموية جيدا والخارجي لدراسة نفاذية المخاطية والتوظيف الكريات البيض في الجسم الحي.

Abstract

واصطف الغشاء المخاطي المعوي من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تشكل حاجزا ديناميكيا يسمح النقل شبه الخلوي من المواد الغذائية والماء مع منع مرور البكتيريا المضيء والمواد الخارجية. يؤدي خرق هذه الطبقة إلى زيادة نفاذية المحتويات الإنارة وتجنيد الخلايا المناعية ، وكلاهما من السمات المميزة للدول المرضية في الأمعاء بما في ذلك مرض الأمعاء الالتهابي (IBD).

الآليات التي تنظم وظيفة الحاجز الظهاري والهجرة عبر الإبطية (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) غير مفهومة بشكل كامل بسبب عدم وجود طرق تجريبية في الجسم الحي تسمح بالتحليل الكمي. هنا، ونحن نصف نموذج تجريبي مورين قوية التي توظف الجزء المعوي الخارجي من القولون إما الايليوم أو قريبة. الحلقة المعوية الخارجية (iLoop) هي الأوعية الدموية بالكامل وتوفر مزايا فسيولوجية على النهج القائمة على غرفة الجسم الحي السابق المستخدمة عادة لدراسة نفاذية وهجرة PMN عبر أحاديات الخلايا الظهارية.

نحن نبين تطبيقين لهذا النموذج بالتفصيل: (1) القياس الكمي نفاذية الأمعاء من خلال الكشف عن ديكسترانس المسمى بالفلورسينس في المصل بعد الحقن داخل الألومين ، (2) التقييم الكمي لPMN المهاجرة عبر الظهارة المعوية في تجويف الأمعاء بعد إدخال المضادات الكيميائية داخل الألومين. نحن نظهر جدوى هذا النموذج وتوفير النتائج باستخدام iLoop في الفئران تفتقر إلى الظهارية ضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A بالمقارنة مع الضوابط. وقد ثبت JAM-A لتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري، فضلا عن PMN TEpM خلال الاستجابات الالتهابية. نتائجنا باستخدام iLoop تؤكد الدراسات السابقة وتسليط الضوء على أهمية JAM-A في تنظيم نفاذية الأمعاء وPMN TEpM في الجسم الحي أثناء التوازن والمرض.

نموذج iLoop يوفر طريقة موحدة للغاية للاستنساخ في دراسات الجسم الحي من التوازن المعوي والالتهاب، وسوف تعزز بشكل كبير فهم وظيفة حاجز الأمعاء والتهاب المخاطية في أمراض مثل IBD.

Introduction

الغشاء المخاطي المعوي يشمل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية المعوية العمودية (IECs)، والخلايا المناعية الكامنة وراء لامينا البربريا والغشاء المخاطي العضلي. إلى جانب دورها في امتصاص المواد الغذائية ، فإن الظهارة المعوية هي حاجز مادي يحمي الجسم الداخلي من البكتيريا commensal الإنارة ، مسببات الأمراض ، والمضادات الغذائية. بالإضافة إلى ذلك، تنسق الخلايا المناعية IECs وlamina propria الاستجابة المناعية التي تحفز إما التسامح أو الاستجابة اعتمادا على السياق والمحفزات. وقد أفيد أن اضطراب الحاجز الظهاري يمكن أن يسبق ظهور التهاب المخاطية المرضية والمساهمة في مرض التهاب الأمعاء (IBD) التي تشمل كل من التهاب القولون التقرحي ومرض كرون1،2،3،4،5،6،7. الأفراد الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي تقديم الهجرة عبر الظهارية المفرطة (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) تشكيل خراجات سرداب, النتيجة التي ارتبطت مع شدة المرض8,9. على الرغم من أن وظيفة الحاجز الظهاري للخطر والاستجابات المناعية المفرطة هي السمات المميزة ل IBD ، إلا أن هناك نقصا في المقايسات التجريبية في الجسم الحي لإجراء تقييمات كمية نفاذية الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في الغشاء المخاطي المعوي.

الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وPMN TEpM توظيف نهج سابقة فيفو غرفة القائمة باستخدام monolayers IEC المستزرعة على غشاء مسامية شبه نفاذية إدراج10،11،12. يتم رصد سلامة الحاجز الظهاري إما عن طريق قياسات المقاومة الكهربائية عبر الإبط (TEER) أو التدفق شبه الخلوي للنظائر الفلوريسين (FITC) المسمى dextran من المقصورة القاعدية13،14،15. وبالمثل، عادة ما تدرس PMN TEpM ردا على chemoattractant التي تضاف في الغرفة السفلى16. يتم وضع PMN في الغرفة العليا وبعد فترة حضانة ، يتم جمع PMN التي هاجرت إلى المقصورة القاعدية وقياسها كميا. في حين أن هذه الأساليب مفيدة وسهلة الأداء وقابلة للاستنساخ للغاية ، فمن الواضح أنها نهج اختزالية ولا تمثل بالضرورة انعكاسا دقيقا للظروف في الجسم الحي.

في الفئران ، والمقايسة الشائعة لدراسة نفاذية الأمعاء paracellular هو عن طريق الفم من gavage FITC - dextran والقياس اللاحقة من FITC - dextran المظهر في مصل الدم13،17. وعيب هذا المقايسة هو أنه يمثل تقييما لسلامة الحاجز العام للجهاز الهضمي بدلا من تقييم المساهمات المعوية الإقليمية. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم ايفانز الأزرق عادة لتقييم تسرب الأوعية الدموية في الجسم الحي18، كما تم استخدامها لتقييم نفاذية المخاطية المعوية في الماوس والفأر19،20،21. يتطلب القياس الكمي لإيفانز الأزرق في الغشاء المخاطي المعوي الاستخراج من الأنسجة التي تستخدم الحضانة في فورماميد بين عشية وضحاها. لذلك ، لا يمكن استخدام نفس النسيج لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وتسلل العدلات.

هنا نسلط الضوء على بروتوكول بسيط يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لجمع البيانات القابلة للاستنساخ حول نفاذية القولون المخاطية والهجرة عبر الإبطية الكريات البيض في الجسم الحي. لذلك، نوصي باستخدام FITC-dextrans التي يمكن اكتشافها بسهولة في مصل الدم دون المساس بسلامة الحلقات المعوية التي يمكن حصادها لمزيد من التحليل. وتجدر الإشارة إلى أن الحلقات المعوية ذات الخلايا المتوارثة قد استخدمت في أنواع مختلفة (بما في ذلك الماوس والفأر والأرنب والعجل) لدراسة العدوى البكتيرية (مثل السالمونيلا والليستيريا أحادية الخلايا والإشريكية القولونية)22و23و24و25 بالإضافة إلى نفاذية الأمعاء26؛ ومع ذلك، على حد علمنا لا توجد دراسات التحقيق آليات PMN TEpM في مناطق محددة في الأمعاء مثل الإيليوم أو القولون التي تشارك عادة في IBD.

هنا نحن نصف الماوس حلقة معوية (iLoop) نموذج الذي هو microsurgical قوية وموثوق بها في طريقة فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء جيدا الأوعية الدموية والخارجية من القولون إما الايليوم أو قريبة. نموذج iLoop ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ويسمح بتقييم سلامة حاجز الأمعاء وPMN TEpM على الفئران الحية تحت التخدير. نحن نثبت تطبيقين: 1) القياس الكمي لمستويات المصل من 4 kDa FITC-dextran بعد الإدارة داخل الألومين في iLoop 2) القياس الكمي لPMN المتحولة في تجويف iLoop بعد الحقن داخل الألومين من اللوكوترين القوي الكيميائي B4 (LTB4)27. وعلاوة على ذلك، الاستفادة من نموذج iLoop مع الفئران جام-أ-فارغةأو الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM-A على IECs(Villin-cre; جام-أ fl/fl)بالمقارنةمع الفئران السيطرة، ونحن قادرون على تأكيد الدراسات السابقة التي أبلغت عن مساهمة كبيرة لضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A إلى نفاذية الأمعاء وهجر العدلات15،28،29،30،31.

نموذج iLoop هو أسلوب وظيفي وفسيولوجي للغاية يمكن استخدامه لتأكيد المقايسات في المختبر. وعلاوة على ذلك، هذا هو نموذج تجريبي متعدد الاستخدامات التي تسمح لدراسة الكواشف المختلفة التي يمكن حقنها في التجويف حلقة، بما في ذلك chemokines، السيتوكينات، مسببات الأمراض البكتيرية، والسموم، والأجسام المضادة والعلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية والسياسات للمعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ميشيغان.

1. التحضير قبل الجراحة

ملاحظة: تم إنشاء هذه الطريقة باستخدام الفئران البالغة من خلفية C57BL/6 الوراثية، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في ظل ظروف صارمة محددة خالية من مسببات الأمراض مع إمكانية الوصول إلى الطعام العادي والماء. تم الحصول على النتائج باستخدام C57BL/6، جام-أ - الفئرانالخالية (جام-أ-/-)أو الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM-A على IECs (Villin-cre; جام-afl/fl)والقمامة جام-afl/fl الضوابط كما وصف سابقا30.

  1. إعداد المنطقة
    1. إجراء عملية جراحية في منطقة نظيفة. نموذج حلقة الأمعاء، ومع ذلك، هو عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة التي لا تتطلب تقنية العقيمة / العقيمة. مراقبة ممارسات الصرف الصحي البيطري واستخدام أدوات جراحية نظيفة (أي تنظيفها بالصابون وشطفها بالماء تليها 70٪ إيثانول).
    2. قم بتشغيل لوح جراحي يتم التحكم في درجة حرارته (أو منصات التدفئة) ومصدر ضوء مكيف للحفاظ على الحيوان من انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير والجراحة.
    3. إعداد الأربطة عن طريق قطع 6 سم شرائح من الغرز الجراحية الحرير غير قابل للامتصاص 4-0.
    4. إعداد شاش القطن (5 سم × 5 سم) التي يتم قطعها في المركز بعد شكل بيضاوي الشكل. وسوف تستخدم هذه لتغطية استئصال البطن خط الوسط ومنع الاتصال المباشر بين iLoop الخارجي والفراء الحيواني. نقع الشاش قطع في الدافئة هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS) في وعاء طبق بتري.
    5. إعداد مسحات القطن الرطب غارقة في HBSS الدافئة التي سيتم استخدامها للتعامل مع الأجهزة و iLoop الخارجي.
    6. إعداد حقنة 10 مل مليئة HBSS الحارة ونرفق أنبوب التغذية الصفراء. سيتم استخدام هذه الحقنة لترطيب الأنسجة المكشوفة أثناء الجراحة ولتنظيف iLoop بلطف من محتوى البراز.
  2. إعداد الحيوان
    1. تخدير الحيوان وفقا لبروتوكول الحيوان المعتمد. في هذا البروتوكول يتم إعطاء مزيج من الأيزوفلوران والأوكسجين من خلال مبخر التخدير. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، ضبط معدل تدفق الأكسجين إلى 1 لتر / دقيقة. تعيين المبخر إلى 5٪ وقبل شحن غرفة التعريفي. بعد 5 دقائق، والحد من المبخر isoflurane إلى 2٪ - 2.5٪.
    2. ضع الحيوان في غرفة التعريفي لمدة 3 دقائق - 5 دقائق ، ثم نقل الحيوان إلى لوحة جراحة ساخنة وتوصيل قابس nosecone التخدير. كبح جماح الحيوان في موقف supine من الأطراف الأربعة باستخدام شريط لاصق.
      ملاحظة: كبديل للتخدير، يمكن إدارة خليط من الكيتامين (80 ملغم/كجم - 100 ملغم/كجم) والزيلازيني (5 ملغم/كجم - 10 ملغم/كجم) مخفف في محلول ملحي (0.9٪ NaCl) عن طريق الحقن داخل الصفاق. يجب الحفاظ على التخدير طوال الجراحة عن طريق الإدارة العضلية للكيتامين / الإكسيلازين (في 0.1 - 0.25 مرة من الجرعات الأولية) لضمان عمق التخدير. إذا كان متوفرا، ينصح بشدة بمبخر التخدير isoflurane لضمان استنساخ أفضل، والبقاء على قيد الحياة ومنع آلام الحيوانات.
    3. تطبيق مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف القرني.
    4. إجراء الفحص البدني الذي يتضمن معدل ضربات القلب (حوالي 500 نبضة / دقيقة) والإيقاع ، ولون الغشاء المخاطي (الوردي) ، ووقت إعادة التعبئة الشعرية (< 2 ثانية) ، ومعدل التنفس (لا تقل عن 40 - 60 نفسا / دقيقة) ، ودرجة الحرارة (36.5 درجة مئوية)32.
    5. قبل الشروع في الخطوات التالية، تقييم عمق مخدر عن طريق دواسة الانسحاب منعكس. استخدمي حافزا مؤلما (قرصة) من الجلد بين أصابع القدم و/ أو منصات إصبع القدم. سوف الماوس الاستجابة عن طريق التعاقد وإزالة ساقه. يختفي هذا المنعكس دواسة عندما يتم تخدير الحيوان بعمق.
      ملاحظة: يوصى بمراقبة الحيوية ومنعكس الدواسة في جميع أنحاء التخدير على الأقل كل 15 دقيقة. توصي إرشادات لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات (IACUC) لتقييم العمق المخدر بمراقبة ما يلي: (أ) لون الذيل والقدم والغشاء المخاطي (مثل اللسان). اللون الوردي كالمعتاد وشاحب أو أزرق كمدلل على انخفاض تدفق الدم أو ضيق في الجهاز التنفسي؛ (ب) تقييم نمط التنفس على أنه أنفاس منتظمة مقابل غير منتظمة. يمكن استخدام مسبار درجة حرارة المستقيم ومقياس أكسدة القوارض وشاشات معدل ضربات القلب لتقييم درجة حرارة الجسم والقلب ومعدلات التنفس على التوالي.

2. جيل حلقة إيلال

  1. إعداد الجلد: فرك فرو خط الوسط البطني مع مسحات الكحول أو إسفنجة شاش غارقة مع الإيثانول 70٪. لا تبلل مساحة واسعة من الفراء مع الكحول لمنع انخفاض حرارة الجسم.
  2. باستخدام مقص، إجراء استئصال البطن خط الوسط. إجراء شق عمودي في منتصف البطن (حوالي 2 سم في الطول) وفضح الصفاق. كن حذرا من عدم إصابة الأعضاء داخل البطن.
  3. ضع شاش القطن الرطب قبل القطع على تجويف البطن المكشوف.
  4. استخدام مسحات القطن الرطب لتعبئة وخارج caecum. ضع بعناية كايكوم على شاش القطن الرطب.
    ملاحظة: يتم توطين Caecum في الربع السفلي الأيسر من تجويف البطن في غالبية الفئران مستقلة عن جنس الحيوان.
  5. استخدام مسحات القطن الرطب لتعبئة وخارج بلطف الايليوم الذي يتم إرفاق القسم المحطة الطرفية (نهاية البعيدة) إلى caecum(الشكل 1B).
  6. نشر ما لا يقل عن 6 سم من الايليوم المحطة على شاش القطن الرطب دون انقطاع الأوعية mesenteric وإمدادات الدم. يتم الحفاظ على إمدادات الدم إذا لم يكن هناك نزيف والأنسجة تحافظ على لونها الوردي(الشكل 1B).
    ملاحظة: تجنب تجفيف الأنسجة المكشوفة عن طريق الحفاظ على ترطيب الأنسجة في جميع الأوقات مع HBSS الدافئ (كل 2 - 3 دقائق) باستخدام حقنة 10 مل متصلة بأنبوب تغذية أصفر (الخطوة 1.1.6).
  7. بالقرب من caecum، تحديد الشريان الرئيسي توريد الايليوم في mesentery. ثم حدد موقعين الربط في mesentery التي هي خالية من الأوعية الدموية الحرجة.
  8. باستخدام ملقط الأنسجة الحادة، والاستيلاء بحزم على الايليوم المحطة الطرفية (الأقرب إلى caecum) واستخدام ملقط تلميح غرامة، fenestrate mesentery تجنب الأوعية الدموية. ضع خياطة الحرير عبر الثقب وربط عقدة جراحية لإنشاء الربط الأول (نهاية الحلقة البعيدة).
  9. استخدم المسطرة لقياس 4 سم بعيدا عن الرباط الأول وإنشاء الرباط الثاني (نهاية قريبة من الحلقة) كما هو مذكور في الخطوة 2.8(الشكل 1C).
  10. مع مقص غرامة قطع بعناية بجانب كل ربط لعزل حلقة ileal 4 سم، والحفاظ على إمدادات الدم سليمة والغشاء mesenteric.
    ملاحظة: قطع طرفي الجزء الخارجي من iLoop، ثم تدفق بلطف كخطوة ضرورية تمنع التداخل مع محتويات مضيئة (البراز)، وبالتالي تسهيل حتى تشتت FITC-dextrans أو المحفزات الكيميائية عبر طول الجزء المعزول وكذلك السماح لقياس كمي أكثر دقة من الكريات البيض عن طريق قياس التدفق الخلوي. يسمح هذا الإجراء أيضا بفك الغشاء المخاطي بشكل موحد بعد حقن كميات محددة من الكاشف وإعادة إنتاج أفضل بين الحيوانات.
  11. قم بتدفق محتوى الجزء الحلقي بلطف باستخدام HBSS الدافئ باستخدام أنبوب تغذية أصفر مرن متصل بحقنة 10 مل (انظر الخطوة 1.1.6).
  12. Ligate طرفي قطع حلقة إيلال مسح باستخدام خياطة الحرير.
  13. استخدم حقنة 1 مل مع إبرة 30 G لحقن 250 ميكرولتر من الكاشف ببطء مثل FITC-dextrans (الخطوة 4.2) أو chemokine (الخطوة 5.3) في التجويف المعوي. الحلقة الإيلالية سوف تضخم مما تسبب في انتفاخ معتدل من الغشاء المخاطي(الشكل 1D).
    ملاحظة: حقن كاشف في التجويف حلقة على الجانب الآخر من الشريان المتوسطي. يجب الحرص على عدم سحب الحلقة الإيلالية من الحيوان أثناء الحقن لتجنب تمزق الأوعية الدموية والحث على النزيف.
  14. باستخدام مسحات القطن الرطب، وضعت بلطف مرة أخرى حلقة إيلال، الايليوم القريبة وcaecum.
  15. استخدام حامل إبرة، ملقط التشريحية و 3.0 الغرز الحرير غير قابل للامتصاص مع إبرة القطع العكسي لإغلاق جدار البطن.
  16. ضع الحيوان في غرفة تخدير منظمة بدرجة الحرارة لفترة الحضانة.

3. جيل من حلقة القولون القريبة (pcLoop)

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول الفئران التي تم استخدامها لإنشاء pcLoop راجع المعلومات المتوفرة في بداية المقطع البروتوكول.

  1. تنفيذ الخطوات 2.1. - 2.4. كما هو موضح أعلاه للحلقة ileal.
  2. باستخدام مسحات القطن الرطب، وخارج الايليوم بأكمله ووضعه على الجزء العلوي من شاش القطن الرطب. تحديد القولون القريبة وإمدادات الدم الموجودة في mesocolon. تعبئة القولون القريبة وباستخدام ملقط تلميح غرامة إنشاء الرباط الأول في منطقة خالية من السفن في mesocolon في حوالي 0.5 سم بعيدا عن caecum (الشكل 2B).
  3. قياس 2 سم من الرباط الأول وإنشاء رباط الثاني في منطقة خالية من إمدادات الدم في mesocolon (الشكل 2C).
  4. باستخدام مقص غرامة قطع بعناية بجانب كل ربط لعزل pcLoop 2 سم طويلة.
    ملاحظة: كما هو مذكور في الملاحظة تحت الخطوة 2.10، من المهم قطع طرفي لعزل pcLoop تنظيف بلطف من محتويات مضيئة. قطع بعناية من خلال النسيج القولوني والميكولون لمنع الأوعية الصغيرة من النزيف في التجويف المعوي. إذا لزم الأمر، استخدم الكي الحراري للحد من النزيف في موقع الشق.
  5. قم بتدفق pcLoop برفق باستخدام HBSS الدافئ لإزالة البراز باستخدام أنبوب تغذية أصفر مرن متصل بحقنة 10 مل (انظر الخطوة 1.1.6).
  6. Ligate طرفي قطع pcLoop مسح باستخدام خياطة الحرير.
  7. استخدم حقنة 1 مل مع إبرة 30G لحقن 200 ميكرولتر من الكاشف ببطء مثل FITC-dextrans (الخطوة 4.2) أو chemokine (الخطوة 5.3) في التجويف المعوي. فإن pcLoop تضخيم مما تسبب في انتفاخ معتدل من الغشاء المخاطي (الشكل 2D).
    ملاحظة: حقن الكاشف في تجويف pcLoop على الجانب الآخر من الشريان المتوسطي. ضمان الاتساق بين الحيوانات وإنشاء pcLoop 2 سم طويلة لضمان استنكار متساوية من الغشاء المخاطي.
  8. الاستفادة من مسحات القطن الرطب لوضع بلطف مرة أخرى pcLoop ربط، الييوم وcaecum في تجويف البطن.
  9. استخدام حامل إبرة، ملقط التشريحية و 3.0 الغرز الحرير غير قابل للامتصاص مع إبرة القطع العكسي لإغلاق جدار البطن.
  10. ضع الحيوان في غرفة تخدير منظمة بدرجة الحرارة لفترة الحضانة.

4. التقييم الكمي نفاذية الأمعاء: 4 kDa FITC-dextran المقايسة

  1. تنفيذ حلقة ileal أو pcLoop (كما هو موضح أعلاه).
  2. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G، وحقن في التجويف المعوي إما 250 ميكرولتر (الإيليوم - الخطوة 2.13) أو 200 ميكرولتر (القولون - الخطوة 3.7) من محلول 4 kDa FITC-dextran (1 ملغ / مل في HBSS). الحفاظ على حل FITC-dextran غير المستخدمة محمية من الضوء لإعداد منحنى القياسية بعد جمع المصل.
  3. لحلقة ileal اتبع الخطوات 2.14 إلى 2.16، لخطوات pcLoop 3.8 إلى 3.10. لفترة وجيزة، وضع الأجهزة و iLoop مرة أخرى في مكانها في تجويف البطن، وإغلاق جدار البطن.
  4. ضع الحيوان لمدة 120 دقيقة في غرفة تخدير ساخنة.
  5. بعد فترة الحضانة فتح جدار البطن، والوصول إلى القلب وإجراء ثقب القلب باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25G لجمع الدم. نقل الدم إلى أنبوب المنشط تجلط المصل 1.3 مل، مزيج بلطف، والحفاظ على الجليد المحمية من الضوء. جمع ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الدم لكل فأر.
    ملاحظة: يتم قتل الحيوانات أثناء التخدير باستخدام طريقة فيزيائية مثل قطع الرأس أو خلع عنق الرحم، ووفقا لبروتوكول الحيوان المعتمد.
  6. أنبوب المنشط تجلط مصل الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز في درجة حرارة الغرفة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. جمع المصل (supernatant) ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل. إبقاء الأنبوب على الجليد وحمايتها من الضوء.
  7. القياس الكمي للفلورسينس في مصل الدم
    1. إعداد منحنى قياسي من FITC-dextran 4 kDa في مصل الفئران التحكم (المالحة أو HBSS هو بديل صالح). إنشاء تخفيف تسلسلي مزدوج مع تركيز يبدأ من 1 ملغم / مل FITC-dextran. تركيزات FITC-dextran 4 kDa التي يتم قياسها تتراوح بين 0.25 ملغم/مل و2 ميكروغرام/مل.
    2. نقل حجم متساو من العينة والمعايير إلى لوحة سوداء 96 جيدا (أسفل مسطح) وقياس FITC في قارئ لوحة مضان (الإثارة 490 نانومتر، الانبعاثات 520 نانومتر)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة والبروتوكولات المنشورة33. حساب تركيز FITC على أساس منحنى القياسية أو القيم نفاذية الحالية كما أضعاف التغيير تطبيع لمجموعة التحكم التجريبية.

5. التقييم الكمي لPMN المهاجرة إلى التجويف المعوي بعد التحفيز داخل الألومين مع chemokines

ملاحظة: عدد قليل جدا PMN يقيمون في الغشاء المخاطي المعوي على مستوى خط الأساس. المعالجة المسبقة للحيوانات مع السيتوكينات الموالية للالتهابات يؤدي إلى بيئة التهابية تسهل تجنيد PMN من مجرى الدم إلى الغشاء المخاطي المعوي.

  1. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G، إجراء الحقن داخل الصفاق (أي p.) من محلول معقم من 100 نانوغرام من عامل نخر الورم α (TNFα) و 100 نانوغرام من إنترفيرون γ (INFа) في 200 ميكرولتر من الفوسفات المالحة العازلة (PBS).
  2. بعد 4 - 24 ساعة من المعالجة المسبقة مع السيتوكينات الموالية للالتهابات ، قم بإجراء حلقة إيلال أو pcLoop (كما هو موضح أعلاه).
  3. باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30 G، وحقن في التجويف المعوي إما 250 ميكرولتر (الإيلوم - الخطوة 2.13) أو 200 ميكرولتر (القولون - الخطوة 3.7) من محلول اللوكوترين B4 (LTB4) 1 nM في HBSS.
    ملاحظة: يستخدم Leukotriene B4 (LTB4)في هذا البروتوكول كمواد كيموتراكتان قوية لPMN. يمكن أيضا استخدام مضادات كيموتراكتين أخرى مثل N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLF) أو chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (CXCL1/KC) للحث على تجنيد كبير لPMN في لومن القولون30.
  4. لحلقة ileal اتبع الخطوات 2.14 إلى 2.16. لpcLoop اتبع الخطوات 3.8 إلى 3.10. لفترة وجيزة، وضع الأجهزة و iLoop مرة أخرى في مكانها في تجويف البطن، وإغلاق جدار البطن.
  5. ضع الحيوان لمدة 60 دقيقة في غرفة تخدير ساخنة.
  6. جمع محتوى الحلقة المعوية
    1. إعداد الحلول وتخزينها على الجليد: لحلقة إيلال وpcLoop، وإعداد عازلة غسل تحتوي على 2 M إيثيلينديامينيتتراستيك حمض (EDTA)، 5 M M Dithiothreitol (DTT) و 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني عقيم دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
    2. بعد فترة الحضانة وتحت التخدير الصيانة، وفتح جدار البطن وسحب iLoop (حلقة إيلال أو pcLoop). قتل الحيوانات عند التخدير باستخدام طريقة فيزيائية مثل قطع الرأس أو خلع عنق الرحم ، ووفقا لبروتوكول الحيوان المعتمد.
    3. شطف حلقة مع برنامج تلفزيوني الباردة لإزالة أي ملوث الدم المتبقية وامتصاص فائض من برنامج تلفزيوني مع مناديل الأنسجة. جمع بعناية محتوى حلقة في أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل (حوالي 250 ميكرولتر للحلقة ileal و 200 ميكرولتر لpcLoop). تدفق حلقة مع 500 ميكرولتر الباردة غسل العازلة، ومباشرة بعد جمع، ووضع أنبوب على الجليد.
      ملاحظة: يساعد DTT على حل المخاط. إذا كان محتوى iLoop الإنارة لزجا جدا (اعتمادا على الخلفية الوراثية للفأرة)، قم بتخفيفه 1:2 أو 1:3 مع مخزن غسيل يحتوي على DTT.
    4. مرر حل المحتوى الإنارة من خلال فلتر شبكة نايلون 35 ميكرومتر باستخدام أنبوب دائري القاع سعة 5 مل مع غطاء مصفاة الخلية. تساعد هذه الخطوة على إزالة شظايا الأنسجة ومجاميع الخلايا. شطف مصفاة الخلية مع 1 مل من العازلة غسل.
    5. أنبوب الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant، شطف بيليه مع 500 ميكرولتر - 1 مل غسل العازلة، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية.
    6. Resuspend iLoop الكريات الخلايا الإنارة في 200 ميكرولتر من تدفق التخزين الخلوي العازلة (FCB) التي تحتوي على 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني عقيم دون الكالسيوم والمغنيسيوم. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في أنبوب أو نقلها إلى لوحة قاع مستديرة من 96 بئرا لتلطيخ وتحليل قياس التدفق الخلوي.
  7. تدفق تلطيخ قياس الخلايا وتحليلها
    1. ضوابط التعويض: خلايا الدم البيضاء
      1. إعداد حقنة 1 مل مع 25 إبرة ز مملوءة مسبقا مع EDTA 0.5 M معقمة (pH 8.0). 10٪ EDTA لكل حجم الدم المتوقع (100 ميكرولتر من EDTA ل1 مل من الدم).
      2. جمع الدم تحت التخدير عن طريق ثقب القلب. نقل الدم إلى أنبوب 1.7 مل، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية.
        ملاحظة: بينما الفأر تحت التخدير استخدام طريقة مادية لتأكيد الموت وفقا لبروتوكول الحيوان المعتمد (مثل خلع عنق الرحم).
      3. يستنشق العملاق. Resuspend بيليه في 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة لتحلل خلايا الدم الحمراء. حضانة لمدة 3 دقائق - 5 دقائق على الجليد. جهاز طرد مركزي 400 × غرام لمدة 5 دقائق، 4 درجات مئوية. إذا كانت بيليه لا تزال حمراء، كرر هذه الخطوة العازلة تحلل ACK حتى بيليه يتحول الأبيض.
      4. Resuspend بيليه في 1 مل FCB ولوحة 0.5 × 106- 1 × 106 من الخلايا في بئر. إعداد خمسة آبار من لوحة مستديرة القاع 96 جيدا. ضع الطبق على الثلج.
        ملاحظة: استخدم نفس اللوحة 96-well التي تحتوي على محتويات حلقة مضيئة (راجع الخطوة 5.6.6).
    2. تدفق تلطيخ قياس الخلايا
      1. الطرد المركزي لوحة 96 جيدا لمدة 5 دقائق في 400 × ز، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الكريات مع 50 ميكرولتر من تنقية الفئران المضادة للفأرة CD16/CD32 كما Fc-Block (1 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر من FCB). حضانة لمدة 5 دقائق - 10 دقيقة على الجليد.
      2. الاحتواء المناعي للمحتوى الإنارة iLoop: إعداد خليط يحتوي على جميع الأجسام المضادة المترافقة مع الفلوروشروم (1:50 تمييع في FCB): مضاد CD45-PerCP، مضاد CD11b-PE ومكافحة Ly-6G-Alexa Fluor 647. إضافة 50 ميكرولتر من الجمع لكل بئر، لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
      3. التشبع المناعي لخلايا الدم البيضاء للتعويضات (1:50 تمييع FCB): استخدم 50 ميكرولتر من FCB وحدها (عينة غير ملطخة ، بئر 1) ، 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد مترافق مع الفلوروشروم الفردي (الآبار 2 - 4) ، 50 ميكرولتر من مزيج جميع الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم (بئر 5). الحجم النهائي 100 ميكرولتر.
      4. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة على الجليد المحمية من الضوء.
      5. الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقائق في 400 × ز، 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وغسل مع 200 ميكرولتر من FCB. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.
      6. إضافة FCB 150 ميكرولتر / جيدا لعينات الدم.
      7. أضف 100 ميكرولتر/جيدا FCB إلى عينة محتوى iLoop الإنارة. ثم 50 ميكرولتر / بئر من حبات العد الفلورية.
    3. تحليل قياس التدفق الخلوي
      1. بوابة لأحداث إيجابية CD45 والتعبير عن Ly-6G-/Gr-1 وCD11b30.
      2. استخدم 100 ميكرولتر من حجم العينة كشرط إيقاف.
      3. حساب العدد المطلق من PMN التي تم ترحيلها إلى التجويف iLoop بعد المعلومات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للخرز العد الفلورسنت.
        ملاحظة: يمكن تقديم البيانات على أنها (1) العدد الإجمالي ل PMN في التجويف30،34،35، (2) عدد PMN لكل غرام من الأنسجة وكذلك (3) عدد PMN لكل مم3 باستخدام الصيغة لحجم الأسطوانة: V = π(pi) r 2 h (V للحجم ، ص لنصف القطر و h للارتفاع).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصور تمثيل تخطيطي لنماذج الحلقة الايلية وpcLoop في الشكل 1 والشكل 2، على التوالي. تعرض الصور التشريحية الخطوات الحرجة للإجراء بما في ذلك المظهر الخارجي للجزء المعوي(الشكل 1B والشكل 2B)، وتحديد موقع مناسب للربط الذي يسمح بأقل قدر من اضطراب إمدادات الدم (الشكل 1C والشكل 2C) والتنظيف يليه ربط نهايات القطع من iLoop التي يمكن ملؤها بمحلول كاشف(الشكل 1D والشكل 2D). الأهم من ذلك، نموذج iLoop يحافظ على إمدادات الدم الحيوية ويسمح الامتصاص الفسيولوجي للكواشف التطبيقية مثل FITC-dextrans أو PMN قوية chemoattractant LTB4. في نهاية المقايسة، ينبغي تضخيم iLoop (كما رأينا في الشكل 1D والشكل 2D)وعرض التخبط المخاطي العادي مع السفن mesenteric مشرق الأحمر. اعتمادا على المقايسة، يتم جمع الدم لقياس FITC-dextran في المصل أو تتم معالجة محتويات الإنارة iLoop للقياس الكمي لPMN TEpM قبل القتل الرحيم للحيوان.

من أجل التحقق من دقة نموذج iLoop لتقييم نفاذية الأمعاء ، تم إجراء فحص PCLoop FITC-dextran لتقييم دور البروتين المرتبط ب TJ JAM-A في تنظيم وظيفة الحاجز المعوي في الجسم الحي. من الجدير بالذكر، وقد أفيد أن نقص JAM-A يؤدي إلى زيادة نفاذية الأمعاء الظهارية في المختبر28 وبعد الغافاج عن طريق الفم في الجسم الحي29. هنا، وذلك باستخدام نموذج pcLoop، زيادة 2.5 أضعاف في 4 KDa FITC-dextran مستويات المصل تم قياسها كميا في جام-أ-فارغة الفئران (جام-أ-/-)مقارنة مع الضوابط (جام-أ+/+)(الشكل 3A)30. وعلاوة على ذلك، تم الحصول على نتائج مماثلة مع الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM-A على IECs(Villin-cre; مربى -a fl/fl)مقارنة بعناصر التحكم فيالقمامة (Jam-a fl/fl)(الشكل 3B)30. لذلك ، كان نموذج pcLoop قادرا على تأكيد الدراسات السابقة التي أبلغت عن مساهمة إيجابية ل JAM-A في وظيفة حاجز الأمعاء.

ثم تم استخدام نموذج pcLoop لدراسة توظيف PMN في الغشاء المخاطي المعوي و TEpM اللاحقة في الجسم الحي. كما هو مبين في الشكل 4A، تم قياس عدد PMN في المحتوى الإنارة من pcLoop من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي. تم تعريف PMN كخلايا إيجابية لكل من صانعي سطح الخلية CD45 و CD11b و Ly6G36. تم استخدام خلايا الدم البيضاء المتداولة كتحكم إيجابي في استراتيجية الغاينج. كما هو متوقع، كان عدد PMN موجودة في جزء من القولون القريبة مماثلة لpcLoop منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية(الشكل 4B). أدى المعالجة المسبقة مع السيتوكينات المؤيدة للالتهابات TNFα وIFNа قبل الجراحة إلى زيادة أعداد PMN المعينة في تجويف pcLoop. إدارة PMN chemoattractant LTB 4 أدى إلىزيادة كبيرة في عدد PMN دعم التوظيف LTB4تعتمد PMN(الشكل 4B). تلطيخ المناعي الكيميائية من PMN في الغشاء المخاطي القولوني تؤكد تجنيد مرتفعة من PMN بعد التحفيز مع السيتوكينات وLTB4 بالمقارنة مع علاج السيتوكين دون LTB4 (الشكل 4C)30. وقد استخدم نموذج pcLoop لدراسة مساهمة JAM-A إلى PMN TEpM باستخدام Villin-cre؛ جام-أ فل/فئران سائلة. فقدان الظهارية JAM-A أدى إلى انخفاض عدد من PMN transmigrated في التجويف القولون مقارنة مع الضوابط littermate (الشكل 4D)30. هذه النتائج تدعم بقوة دورا لJAM-A في تسهيل هجرة PMN عبر ظهارة الأمعاء وتوفير رؤى تكميلية للدراسات التي أبلغت عن مشاركة JAM-A في هجرة PMN عبر بطانة الأوعية الدموية في نماذج مختلفة من الالتهاب31،37،38.

Figure 1
الشكل 1: نموذج حلقة إيلال. (أ) نظرة عامة تخطيطية لنموذج الحلقة الايلالية. يتم إجراء متوسط استئصال البطن على الفئران تحت التخدير ووضعه على لوحة الجراحة التي تسيطر عليها درجة الحرارة. (ب)التميص الخارجي للكيوم (*) والايليوم واليسنتاريا. تم تحديد موقعين مناسبين للربط (1,2). (ج) عزل جزء بطول 4 سم: يتم وضع الرباط الأول (1) بالقرب من تقاطع ileo-caecal ويتم وضع رباط ثان (2) على بعد 4 سم من الرباط الأول. (د)يتم إجراء شقين صغيرين في mesentery (1، 2) لإنشاء حلقة إيلال طول 4 سم. بعد إزالة المحتوى الإنارة وربط قطع نهايات، يمكن حقن الكواشف مثل علامات الفلورسنت وchemattractants في التجويف. الحلقة الايلية هي الأوعية الدموية بشكل جيد (رؤوس الأسهم السوداء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نموذج حلقة القولون القريبة. (A) نظرة عامة تخطيطية لنموذج pcLoop. يتم إجراء متوسط استئصال البطن على الفئران تحت التخدير وضعت على لوحة الجراحة التي تسيطر عليها درجة الحرارة. (ب)الواجهة الخارجية للcaecum (*) ، القولون القريب ، الميكوكولون والايليوم. تم تحديد موقعين مناسبين للربط (1,2). (ج)يتم وضع الرباط الأول (1) بالقرب من caecum ويتم وضع رباط الثاني (2) 2 سم أكثر بعيدا عن الرباط الأول. (د)وpcLoop هو خارجي، وتنظيفها من محتوى مضيئة وتضخم مع الكواشف مثل علامات الفلورسنت وchemaattractants. وpcLoop هو جزء 2 سم الأوعية الدموية جيدا من القولون القريبة (رؤوس الأسهم السوداء تشير إلى إمدادات الدم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: JAM-A ينظم نفاذية الأمعاء في الجسم الحي. (أ) نقص JAM-A (جام-أ-/-)أدى إلى زيادة نفاذية القولون إلى 4 كدا FITC-dextran. تمت مقارنة Jam-a-/- (13x الحيوانات؛ النقاط السوداء) مع ضوابط جام-أ+/+ (12x الحيوانات؛ النقاط البيضاء). 4 kDa FITC-dextran (1 ملغم/مل) في HBSS تم حقنه في تجويف pcLoop. تم قياس الفلورسينس في مصل الدم بعد فترة حضانة مدتها 120 دقيقة. يتم التعبير عن البيانات كوسيلة ± SEM؛ n = 3 تجارب مستقلة. ****P < 0.0001; مان ويتني يو اختبار. (ب) زيادة نفاذية القولون إلى 4 كدا FITC-dextran في فيلين-كر; مربى-a fl/fl (18x الحيوانات، النقاط السوداء) مقارنة مع الضوابط(جام-أfl/fl،12x الحيوانات، النقاط البيضاء). البيانات هي وسيلة ± SEM; n = 4 تجارب مستقلة. ****P < 0.0001; مان ويتني يو اختبار. وقد تم تعديل هذا الرقم من فليمنغ S، لويسنت ACوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: JAM-A يعزز LTB4-تعتمد على تجنيد PMN في التجويف من pcLoop. (أ) Gating استراتيجية لتحديد PMN (CD45+، CD11b+، وLy - 6G / Gr1+ الخلايا) في محتوى مضيئة عن طريق تدفق قياس الخلايا مع حبات العد الفلورسنت. واستخدمت الكريات البيض من عينات الدم كتحكم إيجابي لاستراتيجية الغاينغ. (ب)عدد PMN جندت في التجويف pcLoop بعد السيتوكين (TNFα + IFNа، 100ng لكل منهما) العلاج (10x الحيوانات؛ النقاط البيضاء) أو بعد مزيج من السيتوكينات و 1 NM LTB4 (10x الحيوانات؛ النقاط السوداء). تمثل المربعات السوداء عدد PMN عند خط الأساس كما تم تقييمه في جزء القولون السليم المطابق في الطول لpcLoop الذي لم يخضع لأي عملية جراحية أو علاج بالسيتوكينات proinflammatory وLTB4 (حيوانات 9x). البيانات هي متوسط ± SEM(ن = 3 تجارب مستقلة) ، اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار مقارنة متعددة دان. *P < 0.05، ****P < 0.0001. (ج) تلطيخ المناعية الكيميائية من PMN (المضادة للLy6G/Gr1 الأجسام المضادة) في ظهارة pcLoop بعد العلاج مع السيتوكينات وحدها (لوحة اليسار، TNFα + IFNа) أو مزيج من السيتوكينات وLTB4 (لوحة الحق). يتم زيادة عدد PMN المعينين في pcLoop في وجود LTB4 (رؤوس الأسهم السوداء). شريط المقياس: 100 ميكرومتر (D) عدد PMN المعينين في تجويف pcLoop في فيلين-كر؛ جام-أفل/فلوريدا الفئران (11x الحيوانات; النقاط السوداء) بالمقارنة مع جام-afl/fl الفئران (10x الحيوانات; النقاط البيضاء) ردا على 1 nM LTB4. البيانات هي وسيلة ± SEM; n = 3 تجارب مستقلة. *P < 0.05; 2 الذيل الطالب لا اختبار. وقد تم تعديل هذا الرقم من فليمنغ S، لويسنت ACوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الآليات المسؤولة عن dysregulation من وظيفة حاجز الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في ظل ظروف مرضية مثل IBD غير مفهومة بشكل كامل. هنا، ونحن بالتفصيل قوية في نموذج المورين فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء الخارجية الأوعية الدموية جيدا من القولون إما الايليوم أو قريبة ويسمح لتقييم نفاذية الأمعاء، ودراسات الهجرة العدلات، فضلا عن تطبيقات أخرى.

و iLoop هي عملية جراحية غير الانتعاش التي يتم إجراؤها على الحيوانات الحية. يجب مراقبة التخدير باستمرار على مدار التجربة وتقييم عمق التخدير إلزامي. وتشمل الخطوات الأكثر أهمية (1) عزل iLoop ، (2) ربط نهايات القطع ، و (3) تضخم iLoop عن طريق الحقن داخل الألومين من محلول الكاشف. في كل من هذه الخطوات، يمكن أن يحدث نزيف، مما يعرض للخطر إمدادات الدم من iLoop وتؤثر على دقة النتائج. وتجدر الإشارة إلى أنه في حالات نادرة من النزيف داخل الألومين أثناء فحص PMN TEpM ، ستساعد استراتيجية قياس التدفق الخلوي المعروضة هنا على التمييز بين PMN المتحول من PMN الناشئ مباشرة من مجرى الدم (PMN غير المهاجرة). عبر الممشوق PMN التي تم جمعها في التجويف iLoop التعبير عن مستويات عالية من علامة سطح CD11b10 مقارنة تعميم PMN (الشكل 4D).

وبالنظر إلى أن iLoop يسمح التحليلات الكمية نفاذية المعوية وهجرة PMN الدم إلى التجويف المعوي، من المهم توحيد حجم منطقة المخاطية امتصاص وإمدادات الدم. من أجل ضمان الاتساق بين الحيوانات ، من الضروري أن يتم تهيئة الطول الصحيح للجزء المعوي. وينبغي أن يكون iLoop 4 سم لحلقة إيلال و 2 سم لpcLoop ويكون perfused من إمدادات الدم مماثلة. كما سيؤدي عدم الاتساق في هذه المعلمات إلى عدم المساواة في نزع كمية iLoop بعد الحقن داخل الألومنيوم للكواشف وزيادة التباين بين المجموعات التجريبية وبينها. وعلاوة على ذلك، لتجنب الإفراط في distension من iLoop، نوصي بأن لا يتم حقن أكثر من 250 ميكرولتر من محلول الكاشف في التجويف لحلقة إيلال و 200 ميكرولتر لpcLoop، على التوالي.

هناك بعض القيود المتأصلة في طبيعة الإجراء. و iLoop هي عملية جراحية غير الانتعاش التي يتم إجراؤها على الحيوانات الحية. هذه طريقة جراحية دقيقة صعبة من الناحية الفنية. ومع ذلك، يمكن للموظفين اكتساب المهارات الجراحية من خلال الممارسة. يجب أن يكون متوسط مدة الجراحة قصيرا (بحد أقصى 15 دقيقة). نوصي 120 دقيقة كفترة حضانة مثالية لقياس نفاذية الأمعاء و 60 دقيقة لPMN TEpM. يمكن تقليل أوقات الحضانة ، ولكن قد تؤثر النقاط الزمنية الممتدة على الحالة الالتهابية الشاملة للحيوان تحت التخدير. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن إيقاف البروتوكول من بداية العملية الجراحية إلى جمع العينات / تحليلها مؤقتا.

يقدم نموذج iLoop هذا مزايا رئيسية فيما يتعلق بالطرق الحالية: (1) يتم إضفاء الطابع الوعائي الكامل على iLoop وهو أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ، (2) على النقيض من طريقة الغافاج الفموية التي تقيم سلامة الجهاز الهضمي بشكل عام وتعتمد على الحركة المعدية المعوية13، يسمح iLoop بدراسة خصائص مناطق محددة مترجمة في الأمعاء (الايليوم الطرفي أو القولون القريب) التي تشارك عادة في IBD ، (3) و iLoop هو الأول في نموذج فيفو التي تسمح للدراسة الكمية من TEpM PMN في تجويف الأمعاء، فضلا عن أجزاء أخرى من الغشاء المخاطي المعوي, بما في ذلك البروبريا الصفيحة والفصائل الظهارية30,35. فمن الممكن لتوظيف عالية مقابل انخفاض الوزن الجزيئي FITC المسمى dextrans (4 إلى 150 كدا) لتقييم كل من الانتقائية حجم و / أو شدة عيوب الحاجز الظهاري في الفئران بالضربة القاضية / ضرب في أو نماذج تجريبية مختلفة بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، التهاب الأمعاء. وبالإضافة إلى ذلك يمكن قياس dextrans FITC المسمى في أجهزة أخرى مثل الكبد39 أو كنهج جديد لدراسات حاجز الدم في الدماغ توفير رؤى في دور نفاذية الأمعاء في الأمعاء الكبد ومحاور الأمعاء والدماغ40،41،42. وعلاوة على ذلك، توفر هذه الطريقة إمكانية إجراء حلقتين بالتوازي (حلقة إيلال وpcLoop في نفس الحيوان) وغرس مسبارين مختلفين المسمى الفلورسنت لتحليل خصائص الحاجز في مناطق متميزة في الأمعاء. وعلى نفس المنوال، يمكن استخدام جيل من حلقتين بالتوازي لتقييم الإيليوم مقابل القولون على وجه التحديد للاختلافات أو أوجه التشابه في توظيف الخلايا المناعية استجابة لنفس الكاشف.

هنا ، باستخدام pcLoop مع الفئران جام أخالية أو الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM - A على IECs(Villin - cre ؛ Jam-a fl/fl)،نحن نؤكد النتائج المستخلصة من الدراسات السابقة التي أبلغت عن دور إيجابي للبروتين JAM-A المرتبط ب TJ في نفاذية الأمعاء وPMN TEpM. يمكن توسيع تطبيقات iLoop إلى الكواشف المختلفة بما في ذلك الأجسام المضادة ومسببات الأمراض الميكروبية والأدوية العلاجية30و34و35. من الجدير بالذكر، استخدمنا LTB4 (336.5 دا) لنموذج PMN TEpM نظرا لأنه هو مقبول جيدا قوية وفسيولوجية PMN chemoattractant وقدرته على حث TEpM بتركيزات منخفضة (1 nM) في النطاق الفسيولوجي. ومع ذلك ، فإن نموذج الحلقة لدينا قابل للتكيف مع مضادات الكيميائية الأخرى ذات الصلة. لقد أبلغنا عن استخدام الببتيد البكتيري N-فورميل-ميثيونيل-ليوسيل-فينيل ألانين (fMLF) للحث على تجنيد كبير من PMN في التجويف القولوني30. fMLF (437.5 دا) هو أقل تقارب chemoattractant في الفئران التي تتطلب تركيزات أعلى بكثير لتكون فعالة (1μM). هذا النموذج قابل للتكيف لاستخدام CXCL1/KC، وهو كيميائي فسيولوجي قوي آخر استخدمناه بنجاح، ومع ذلك فإن CXCL1/KC مكلف وجزيئ كبير نسبيا (11 كيلودا) أقل كفاءة في عبور الحاجز الظهاري. كما أثبتنا أن تحييد الأجسام المضادة ضد الخلايا البيضاء محددة INTEGRIN CD11b/CD18 (αMαα2) التي تم حقنها في حلقة التجويف قبل إدارة CHEMOattractant LTB4 أدى إلى انخفاض PMN TEpM نتائج داعمة من الدراسات المختبرية10,30,35. وعلاوة على ذلك، تم استخدام pcLoop مؤخرا لدراسة تأثير PMN مقابل الجليكان الظهارية في السيطرة على معدل PMN TEpM43. تم حقن الكواشف في تجويف pcLoop قبل إدارة المعالج الكيميائي LTB4. لذلك ، مع طيف واسع من التطبيقات ، يمكن لل iLoop إكمال وتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق المقايسات المختبرية. كما تم استخدام الحلقات المعوية المربطة من قبل الآخرين لدراسة العدوى البكتيرية (مثل السالمونيلا ، L. monocytogenes و E. coli)، لذلك نعتقد أنه يمكن استخدام سهولة التكيف مع نموذج iLoop هذا لهذه الدراسات أيضا.

بعد العلاج مع الوسطاء المناعيين المؤيدين للالتهابات ، يمكن استخدام iLoop كنموذج حاد للالتهاب المعوي. وعلاوة على ذلك، قد تمكن iLoop الدراسات التي توضح الصلة بين زيادة نفاذية الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية بعد التعرض لمسببات الأمراض داخل الألومين أو في النماذج التجريبية الالتهابية المزمنة. من الجدير بالذكر، لاحظنا مؤخرا من خلال توظيف نموذج pcLoop أنه استجابة لجرعة عالية من السيتوكينات proinflammatory TNFα وIFNа (1 ملغ من كل) نفاذية شبه الخلية المعوية إلى 4 kDa FITC-dextran أدى إلى تعزيز تجنيد PMN في تجويف pcLoop ردا على LTB4 بالمقارنة مع جرعة منخفضة من السيتوكينات (100 نانوغرام من كل)30. ومن المثير للاهتمام، وهنا نظهر أن زيادة نفاذية الظهارية الثانوية لنقص جام-A لم يؤد إلى تعزيز PMN TEpM ولكن تضاءلت عليه. كل هذه النتائج مجتمعة تشير إلى أن نفاذية شبه الخلية المعوية يؤثر على معدل PMN TEpM ولكن الارتباط ليس مباشرا ويعتمد على عوامل مثل التعبير عن جزيئات التصاق (على غرار JAM-A) التي تلعب دورا هاما في كل من وظيفة الحاجز الظهاري وهجرة الكريات البيض16. هناك حاجة إلى دراسات مستقبلية للتحقيق في الضبط الدقيق لاستجابات الخلايا المناعية عن طريق ظهارة الأمعاء ، والمساهمات في التهاب المخاطيات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء.

في الختام، يوفر نموذج iLoop تحسنا كبيرا في النهج القائمة لتقييم نفاذية الأمعاء وPMN TEpM في الجسم الحي من شأنها أن تساعد بشكل كبير في فهم الآليات الكامنة وراء تنظيم التهاب الأمعاء وIBD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور سفين فليمنغ من جامعة فيرزبورغ على مساهماته في إنشاء نموذج حلقة القولون القريبة ، وشون واتسون لإدارة مستعمرات الماوس وتشيثرا ك. موراليداران للمساعدة في الحصول على صور نموذج iLoop. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية /DFG (BO 5776/2-1) إلى KB وR01DK079392 وR01DK072564 وR01DK061379 إلى C.A.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs BD 326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8" BD 305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2" BD 305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle BD 309659
15ml Centrifuge Tube Corning 14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate FisherScientific 07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm MilliporeSigma CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile FisherScientific 25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2" Medex 3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units) E-Z Systems EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  VWR 21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape FisherScientific 15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)  FST 12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe) FisherScientific 06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes  Thomas Scientific  c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube) Sarstedt  41.1501.105
Moria Fine Scissors FST 14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh) Falcon 352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant Dechra 12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps) FST 11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD FisherScientific NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps) FST 1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting  HenrySchein SS694
Student Fine Forceps, Angled FST 91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma  Z248029
96 Well Cell Culture Plate Corning 3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm Instech FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA Lonza 51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer BioWhittaker 10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution Corning 21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium Corning 21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8) BioLegend 127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70) ThermoFisher 12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen C36950
Dithiotreitol FisherScientific BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated R&D Systems 511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000 Sigma 60842-46-8
Isoflurane Halocarbon 12164-002-25
Leukotriene B4 Millipore Sigma 71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11) BD Pharmingen 557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block) BD Bioscience 553142
Recombinant Murine IFN-γ Peprotech 315-05
Recombinant Murine TNF-α Peprotech 315-01A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olson, T. S., et al. The primary defect in experimental ileitis originates from a nonhematopoietic source. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 541-552 (2006).
  2. Jump, R. L., Levine, A. D. Mechanisms of natural tolerance in the intestine: implications for inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 10 (4), 462-478 (2004).
  3. Peeters, M., et al. Clustering of increased small intestinal permeability in families with Crohn's disease. Gastroenterology. 113 (3), 802-807 (1997).
  4. Michielan, A., D'Inca, R. Intestinal permeability in inflammatory bowel disease: Pathogenesis, clinical evaluation, and therapy of leaky gut. Mediators of Inflammation. 2015, 628157 (2015).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Neutrophil transepithelial migration and epithelial barrier function in IBD: potential targets for inhibiting neutrophil trafficking. Annals of the New York Academy of Sciences. 1072, 276-287 (2006).
  6. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  7. Ordás, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  8. Muthas, D., et al. Neutrophils in ulcerative colitis: A review of selected biomarkers and their potential therapeutic implications. Scandanavian Journal of Gastroenterology. 52 (2), 125-135 (2017).
  9. Pai, R. K., et al. The emerging role of histologic disease activity assessment in ulcerative colitis. Gastrointestinal Endoscopy. 88 (6), 887-898 (2018).
  10. Parkos, C. A., Delp, C., Arnaout, M. A., Madara, J. L. Neutrophil migration across a cultured intestinal epithelium. Dependence on a CD11b/CD18-mediated event and enhanced efficiency in physiological direction. The Journal of Clinical Investigation. 88 (5), 1605-1612 (1991).
  11. Brazil, J. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil-epithelial interactions. Immunological Reviews. 273 (1), 94-111 (2016).
  12. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterology. 19 (1), 98 (2019).
  13. Li, B. R., et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).
  14. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  15. Fan, S., et al. Role of JAM-A tyrosine phosphorylation in epithelial barrier dysfunction during intestinal inflammation. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 566-578 (2019).
  16. Parkos, C. A. Neutrophil-epithelial interactions: A double-edged sword. American Journal of Pathology. 186 (6), 1404-1416 (2016).
  17. Volynets, V., et al. Assessment of the intestinal barrier with five different permeability tests in healthy C57BL/6J and BALB/cJ mice. Digital Diseases and Sciences. 61 (3), 737-746 (2016).
  18. Wick, M. J., Harral, J. W., Loomis, Z. L., Dempsey, E. C. An optimized evans blue protocol to assess vascular leak in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (139), e57037 (2018).
  19. Tateishi, H., Mitsuyama, K., Toyonaga, A., Tomoyose, M., Tanikawa, K. Role of cytokines in experimental colitis: relation to intestinal permeability. Digestion. 58 (3), 271-281 (1997).
  20. Mei, Q., Diao, L., Xu, J. M., Liu, X. C., Jin, J. A protective effect of melatonin on intestinal permeability is induced by diclofenac via regulation of mitochondrial function in mice. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (4), 495-502 (2011).
  21. Vargas Robles, H., et al. Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55095 (2017).
  22. Arques, J. L., et al. Salmonella induces flagellin- and MyD88-dependent migration of bacteria-capturing dendritic cells into the gut lumen. Gastroenterology. 137 (2), 579-587 (2009).
  23. Coombes, B. K., et al. Analysis of the contribution of Salmonella pathogenicity islands 1 and 2 to enteric disease progression using a novel bovine ileal loop model and a murine model of infectious enterocolitis. Infection and Immunity. 73 (11), 7161-7169 (2005).
  24. Everest, P., et al. Evaluation of Salmonella typhimurium mutants in a model of experimental gastroenteritis. Infection and Immunity. 67 (6), 2815-2821 (1999).
  25. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infection and Immunity. 66 (2), 747-755 (1998).
  26. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. The Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2702-2715 (2005).
  27. Palmblad, J., et al. Leukotriene B4 is a potent and stereospecific stimulator of neutrophil chemotaxis and adherence. Blood. 58 (3), 658-661 (1981).
  28. Mandell, K. J., Babbin, B. A., Nusrat, A., Parkos, C. A. Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelial cell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1 activity. The Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 11665-11674 (2005).
  29. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  30. Flemming, S., Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. Analysis of leukocyte transepithelial migration using an in vivo murine colonic loop model. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (20), (2018).
  31. Luissint, A. C., Nusrat, A., Parkos, C. A. JAM-related proteins in mucosal homeostasis and inflammation. Seminars in Immunopathology. 36 (2), 211-226 (2014).
  32. Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Lab Animal. 44 (4), 329-336 (2010).
  33. JoVE Science Education Database. Introduction to the Microplate Reader. Journal of Visualized Experiments. , JoVE, Cambridge, MA. e5024 (2020).
  34. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  35. Azcutia, V., et al. Neutrophil expressed CD47 regulates CD11b/CD18-dependent neutrophil transepithelial migration in the intestine in vivo. Mucosal Immunology. , (2020).
  36. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PloS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  37. Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series). Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).
  38. Ebnet, K. Junctional Adhesion Molecules (JAMs): Cell adhesion receptors with pleiotropic functions in cell physiology and development. Physiological Reviews. 97 (4), 1529-1554 (2017).
  39. Sorribas, M., et al. FXR modulates the gut-vascular barrier by regulating the entry sites for bacterial translocation in experimental cirrhosis. Journal of Hepatology. 71 (6), 1126-1140 (2019).
  40. Mazzucco, M. R., Vartanian, T., Linden, J. R. In vivo Blood-brain Barrier Permeability Assays Using Clostridium perfringens Epsilon Toxin. Bio-Protocol. 10 (15), 3709 (2020).
  41. Kelly, J. R., et al. Breaking down the barriers: the gut microbiome, intestinal permeability and stress-related psychiatric disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 392 (2015).
  42. Fiorentino, M., et al. Blood-brain barrier and intestinal epithelial barrier alterations in autism spectrum disorders. Molecular Autism. 7 (1), 49 (2016).
  43. Kelm, M., et al. Regulation of neutrophil function by selective targeting of glycan epitopes expressed on the integrin CD11b/CD18. FASEB Journal : An Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (2), 2326-2343 (2020).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 168، وظيفة الحاجز المعوي، علم المناعة المخاطية، ظهارة الأمعاء، مقايسة نفاذية، فحص الهجرة عبر الإبط الكريات البيض، حلقة الإيل، حلقة القولون القريبة، إيزوثيوسيانات الفلورسنت (FITC)-dextran، chemokine، السيتوكين الاليوني
التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boerner, K., Luissint, A. C.,… More

Boerner, K., Luissint, A. C., Parkos, C. A. Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model. J. Vis. Exp. (168), e62093, doi:10.3791/62093 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter