Fedtdækket øtransplantation ved hjælp af epididymalt hvidt fedtvæv

Summary

Denne fedtdækkede øtransplantationsmetode er egnet til påvisning af indpodede øer i intraperitonealhulen. Det kræver især ikke brug af biobindingsmidler eller suturering.

Abstract

Ø transplantation er en cellulær erstatningsterapi for svær diabetes mellitus. Intraperitonealhulen er typisk transplantationsstedet for denne procedure. Imidlertid har intraperitoneal øtransplantation nogle begrænsninger, herunder dårlig transplantationseffektivitet, vanskelig transplantatdetektionsevne og manglende graftektomikapacitet til analyse efter transplantation. I dette papir bruges “fedtdækket øtransplantation”, en intraperitoneal øtransplantationsmetode, der anvender epididymalt hvidt fedtvæv, til at vurdere de terapeutiske virkninger af bioengineered holme. Metodens enkelhed ligger i såning af holme på epididymalt hvidt fedtvæv og brug af vævet til at dække øerne. Mens denne metode kan kategoriseres som en intraperitoneal øtransplantationsteknik, deler den egenskaber med intra-fedtvævsøtransplantation. Den fedtdækkede øtransplantationsmetode viser imidlertid mere robuste terapeutiske virkninger end intra-fedtvævsø-øtransplantation, herunder forbedring af blodsukker- og plasmainsulinniveauer og potentialet for transplantatfjernelse. Vi anbefaler vedtagelsen af denne metode til vurdering af mekanismerne for holmens indkapsling i hvidt fedtvæv og de terapeutiske virkninger af bioengineered holme.

Introduction

Hældningstransplantation er en cellulær erstatningsterapi til patienter med svær diabetes mellitus. Nylige rapporter har vist, at antallet af insulinuafhængighed tre år efter transplantation forbedres op til 44%¹ , og at ca. 80% af modtagerne, der modtager mere end 600.000 samlede ø-ækvivalenter, opnår insulinuafhængighed². Desuden blev det i den seneste Collaborative Islet Transplant Registry-rapport afsløret, at fastende blodsukkerniveauer blev opretholdt på 60-140 mg / dL i over en periode på 5 år hos over 70% af patienterne, der gennemgik øtransplantation alene. Undersøgelsen fastslog også, at omkring 90% af de patienter, der fik øtransplantation alene eller øtransplantation efter nyretransplantation, ikke udviklede nogen alvorlige hypoglykæmiske hændelser i over 5 år³.

Selvom de kliniske resultater af denne behandling er blevet bedre, skal der stadig tages fat på nogle begrænsninger, herunder nødvendigheden af at etablere et optimalt transplantationssted. Leveren er et typisk transplantationssted for klinisk øtransplantation, fordi det er det største organ, der kan rumme et stort volumen af holme. Hos nogle patienter er leveren imidlertid ikke tilgængelig (f.eks. på grund af portalhypertension, hepatitis og / eller cirrose⁴) og derfor andre steder, herunder det renale subkapsulære rum^5,6, omental pose 7,8,9,10, mesentri 11, mave-tarmkanalen 12, skeletmuskulatur 13, subkutant væv 13^, knoglemarv 14 og milt ^{15 ,16,17}, er blevet betragtet som alternative transplantationssteder.

Selvom intraperitoneal øtransplantation let kan udføres under lokalbedøvelse, hvilket gør intraperitonealhulen til et tiltalende sted for klinisk øtransplantation, spredes øerne ved transplantation gennem hele intraperitonealhulen, hvilket gør ø-engraftmentdetektion og vellykket engraftmentbekræftelse vanskelig. Derfor er intraperitonealhulen ikke bredt anerkendt som et ideelt klinisk transplantationssted. I stedet bruges det ofte som en kontrolmodel til prækliniske undersøgelser for at undersøge effektiviteten af transplanterede indkapslede¹⁸ og bioengineered holme¹⁹. En nøjagtig sammenligning mellem bioengineered og kontroløer er imidlertid vanskelig at opnå på grund af udfordringerne med at udføre en nøjagtig engraftmentvurdering.

I modsætning hertil er brugen af intraperitonealt hvidt fedtvæv i omentalposen⁸, mesenteriet og andre ekstrahepatiske steder blevet godt rapporteret 10,20,21,22,23, og mange af de undersøgelser, der undersøgte funktionen af bioengineered holme transplanteret ved hjælp af hvidt fedtvæv, var i stand til at rapportere lovende terapeutiske resultater^{20,24,25, 26}. Da brugen af epididymalt fedtvæv letter påvisning af transplanterede øer, blev den “fedtdækkede øtransplantationsmetode”, der anvender epididymalt fedtvæv, udviklet til at overvinde begrænsningerne ved intraperitoneal øtransplantation. I dette papir beskrives fedtdækket øtransplantation ved hjælp af epididymalt fedtvæv.

Protocol

Følgende procedure udføres i tre trin. Det første trin omfatter induktion af diabetes hos modtagermusene og isolering af donorøer. Det andet trin indebærer forberedelse af holme før transplantation. I det tredje trin udføres øtransplantation på epididymalt fedtvæv og dækning af øerne ved hjælp af fedtvævet. Derefter blev de terapeutiske virkninger vurderet. Håndteringen af musene og de eksperimentelle procedurer, der er udført i denne undersøgelse, er i overensstemmelse med ” Principper for laboratoried…

Representative Results

For at sammenligne transplantationseffekten af fedtdækket øtransplantation med den efter intraperitoneal øtransplantation blev det samme antal holme implanteret på peritoneum i det venstre parakole rum af kontrolmodtagende diabetiske dyr. Blodglukoseniveauerne hos mus med fedtdækket øtransplantation blev observeret til gradvist og signifikant fald sammenlignet med intraperitoneale øtransplanterede mus (p = 0,0023; Figur 3A). En måned efter transplantationen blev blodglukosen hos mus …

Discussion

Den fedtdækkede øtransplantationsmetode inkorporerer teknikker fra to forskellige transplantationsteknikker: intraperitoneal øtransplantation og intrafedtvævsøtransplantation. Da overflademembranen af epididymalt hvidt fedtvæv anses for at være det hvide fedtvæv, der er dækket af peritoneum, og som er knyttet til epididymis, kan den fedtdækkede øtransplantationsmetode anatomisk kategoriseres som en type intraperitoneal øtransplantation. Teknikken, hvormed øerne leveres til modtagerdyret, ligner imidlertid me…

Materials

4-0 Nylon	Alfresa	ER2004NA45-KF2	Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig	Jackson Immunoresearch	706-546-148	Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit	Jackson Immunoresearch	711-606-152	Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11885084	Culturing islets, transplanting islets
Eosin	Fujifilm Wako Chemicals	051-06515	Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL	Eppendorf	30120086	Collecting islets
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352095	Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer	Falcon	352340	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352070	Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin	Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)	IR002	Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin	Muto Pure Chemicals Co., Ltd.	30002	Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10%	Shionogi&Co., Ltd.	no catalog number	Using for disinfection
Isoflurane	Fujifilm Wako Chemicals	095-06573	Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1177-965-008	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips	Labcon	1179-965-008	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor	Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,	8AEB02E	Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000	Gilson	F123602	Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200	Gilson	F123601	Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF	Abcam	ab6994	Primary antibody for murine von Willebrand factor