Аппарат для обнуления сна: высокоэффективный метод лишения сна дрозофилы
Summary
Лишение сна является мощным инструментом для исследования функции сна и регуляции. Мы описываем протокол лишения сна дрозофилы с помощью аппарата Sleep Nullifying и определения степени отскока сна, вызванного лишением.
Abstract
Гомеостаз сна, увеличение сна, наблюдаемое после потери сна, является одним из определяющих критериев, используемых для идентификации сна во всем животном мире. Как следствие, лишение сна и ограничение сна являются мощными инструментами, которые обычно используются для понимания функции сна. Тем не менее, эксперименты с лишением сна по своей сути проблематичны в том, что сам стимул депривации может быть причиной наблюдаемых изменений в физиологии и поведении. Соответственно, успешные методы лишения сна должны держать животных в сознании и, в идеале, приводить к надежному восстановлению сна, не вызывая также большого количества непреднамеренных последствий. Здесь мы описываем технику лишения сна для Drosophila melanogaster. Аппарат аннулирования сна (SNAP) вводит стимул каждые 10 с, чтобы вызвать отрицательный геотаксис. Хотя стимул предсказуем, SNAP эффективно предотвращает >95% ночного сна даже у мух с высоким драйвом сна. Важно отметить, что последующая гомеостатическая реакция очень похожа на ту, которая достигается с помощью депривации рук. Время и интервал стимулов могут быть изменены, чтобы свести к минимуму потерю сна и, таким образом, изучить неспецифическое влияние стимула на физиологию и поведение. SNAP также может использоваться для ограничения сна и оценки порогов возбуждения. SNAP – это мощная техника нарушения сна, которая может быть использована для лучшего понимания функции сна.
Introduction
Сон почти универсален у животных, но его функция остается неясной. Гомеостаз сна, компенсаторное увеличение сна после лишения сна, является определяющим свойством сна, которое было использовано для характеристики состояний сна у ряда животных1,2,3,4,5.
Сон у мухи имеет много общего со сном человека, в том числе сильную гомеостатическую реакцию на потерю сна4,5. Многочисленные исследования сна у мухи использовали лишение сна как для определения функции сна, изучая неблагоприятные последствия, возникающие при длительном пробуждении, так и для понимания регуляции сна путем определения нейробиологических механизмов, контролирующих гомеостатическую регуляцию сна. Таким образом, было показано, что лишенные сна мухи демонстрируют нарушения в обучении и памяти6,7,8,9,10,11,12,структурную пластичность13,14,15,зрительное внимание16,восстановление после повреждения нейронов17,18,брачное и агрессивное поведение19, 20,пролиферация клеток21и реакции на окислительный стресс22,23, чтобы назвать несколько. Кроме того, исследования нейробиологических механизмов, контролирующих отскок сна, дали критическое представление о нейронном механизме, который составляет гомеостат сна8,9,23,24,25,26,27,28,29 . Наконец, в дополнение к выявлению фундаментального понимания функции сна у здоровых животных, исследования депривации сна также дали представление о функции сна в больных состояниях30,31.
Хотя лишение сна, несомненно, является мощным инструментом, при любом эксперименте по лишению сна важно различать фенотипы, которые являются результатом длительного бодрствования, от тех, которые вызваны стимулом, используемым для бодрствования животного. Лишение сна путем лишения рук или мягкого обращения, как правило, рассматривается как установление стандарта для минимально разрушительного лишения сна. Здесь мы описываем протокол для мух, лишающих сна, с помощью аппарата sleep Nullifying Apparatus (SNAP). SNAP – это устройство, которое обеспечивает механический стимул для мух каждые 10 с, удерживая мух в сознании, вызывая отрицательный геотаксис(рисунок 1). SNAP эффективно лишает мух >98% ночного сна, даже у мух с высоким драйвом сна8,32. SNAP был откалиброван на чувствительных к удару мух, перемешивание мух в SNAP не вредит мухам; лишение сна с помощью SNAP вызывает отскок, сравнимый с полученным при лишении рук7. Таким образом, SNAP является надежным методом лишения сна мух, контролируя при этом эффекты возбуждающего стимула.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сон у дрозофилы был независимо охарактеризован в 2000 году двумягруппами4,5. В этих новаторских исследованиях мухи были лишены сна из-за мягкого обращения (то есть лишения рук) и показали, что они демонстрируют надежную гомеостатическую реакцию на ночн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH 5R01NS051305-14 и 5R01NS076980-08 для PJS.
Materials
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
- Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
- Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
- Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
- Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
- Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
- Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
- Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
- Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
- Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
- Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
- Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
- Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
- Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
- Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
- Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
- Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
- Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
- Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
- Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
- Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
- Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
- Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
- Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
- Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
- Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
- Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
- Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
- Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
- Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
- Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
- Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
- Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).
