Undersøgelsen af fedtacylation har vigtige implikationer i cellulære proteininteraktioner og sygdomme. Præsenteret her er en modificeret protokol til forbedring af klikkemidetektion af fedt acylerede proteiner, som kan anvendes i forskellige celletyper og kombineres med andre assays, herunder pulsjagt og massespektrometri.
Fedtacylation, den kovalente tilsætning af mættede fedtsyrer til proteinsubstrater, er vigtig for at regulere et utal af cellulære funktioner ud over dets konsekvenser i kræft og neurodegenerative sygdomme. Den seneste udvikling inden for metoder til påvisning af fedtacylation har muliggjort effektiv og ikke-farlig påvisning af fedtacylaterede proteiner, især ved brug af klikkemi med bioortogonal mærkning. Imidlertid kan klikkemidetektion begrænses af den dårlige opløselighed og potentielle toksiske virkninger ved at tilføje langkædede fedtsyrer til cellekultur. Beskrevet her er en mærkningsmetode med optimeret levering ved hjælp af forsæbte fedtsyrer i kombination med fedtsyrefri BSA samt delipiderede medier, som kan forbedre påvisning af svært detekterede fedt acylerede proteiner. Denne effekt var mest udtalt med alkynyl-stearatanalogen, 17-ODYA, som har været den mest almindeligt anvendte fedtsyreanalog i klikkemidetektion af acylerede proteiner. Denne ændring vil forbedre cellulær inkorporering og øge følsomheden over for acyleret proteindetektion. Derudover kan denne tilgang anvendes i en række celletyper og kombineres med andre assays såsom pulsjagtanalyse, stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur og massespektrometri til kvantitativ profilering af fedtacylerede proteiner.
Fedtacylation involverer kovalent tilsætning af fedtsyrer til proteiner og er kendt for sin betydning for at fremme protein-membraninteraktioner, men har også vist sig at fremme protein-protein-interaktioner, konformationsændringer og regulere katalytiske steder af enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fedt acylation har vist sig som et potentielt lægemiddelmål i et utal af sygdomme, herunder infektion, kræft, betændelse og neurodegeneration, hvor forstyrrelser i palmitoylering er blevet dokumenteret8,9,10,11,12,13. Dette er primært blevet ansporet af udviklingen af nye kemiske detektionsmetoder, som muliggjorde storstilet identifikation af S-acylerede proteinmål.
Fedtacylering kan omfatte en række modifikationer, der involverer kovalent tilsætning af mættede og umættede fedtsyrer, men refererer typisk til N-myristoylering og S-acylation. N-myristoylering refererer til tilsætning af myristinsyre til N-terminale glyciner enten co-translationelt på spirende polypeptider eller post-translationelt på nyligt eksponerede N-terminale glyciner efter proteolytisk spaltning2,14. N-myristoylering sker gennem en irreversibel amidbinding. På den anden side refererer S-acylation typisk til den reversible tilsætning af langkædede fedtsyrer til cysteinrester via en thioesterbinding. Den mest almindelige form for denne ændring omfatter inkorporering af palmitat og kaldes derfor almindeligvis S-palmitoylering eller simpelthen palmitoylering11,15. På mange måder ligner S-palmitoylering fosforylering. Det er dynamisk, enzymatisk reguleret og viser sig at være meget trækbart.
Indtil det sidste årti blev studiet af fedtacylation forhindret af begrænsede detektionsmetoder, som krævede radioaktivt mærkede fedtsyrer. Dette havde flere ulemper, herunder omkostninger, sikkerhedsproblemer og meget lange detektionstider. Typisk blev enten tritieret eller ioderet palmitat anvendt til påvisning af S-acylation16. Tritiated palmitat krævede lange detektionsperioder med autoradiografifilm, som kan tage uger til måneder. Mens [125I] iod-fedtsyreanaloger forkortede detektionstiderne, udbød det en meget højere sikkerhedsrisiko og krævede tæt skjoldbruskkirtelovervågning af eksperimenter. Derudover var disse metoder ikke-kvantitative, hvilket derfor begrænsede evnen til at måle dynamisk palmitoylering og også tidskrævende at opsætte og rydde op på grund af det ekstra personlige beskyttelsesudstyr og radioaktiv overvågning. Endelig var radioaktive etiketter ikke velegnede til proteomiske undersøgelser og typisk begrænset til påvisning af lav gennemstrømning af specifikke proteiner af interesse. Efterhånden som flere substrater blev påvist, og uundgåeligt de enzymer, der formidler hver modifikation, blev identificeret, var det klart, at der var behov for nye detektionsmetoder17,18,19,20,21. Næsten samtidig opstod der flere nye metoder til påvisning af fedtaylerede proteiner. Den første udnytter reversibiliteten og reaktiviteten af thioesterbindingen af S-acylation. ACYL-biotin-udvekslingsassayet (ABE) erstatter kemisk palmitat med biotin til efterfølgende tilbagetrækning af S-acylerede proteiner ved hjælp af avidin agaroseperler og direkte påvisning ved western blot22,23,24. Dernæst blev bio-ortogonal mærkning af fedtsyrer og kemoselektiv tilsætning til tags eller håndtag udviklet, der omfattede brugen af Staudinger ligation og klikkemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Endelig erstatter acylharpiksassisteret fangst (RAC) i lighed med ABE i det væsentlige S-acylerede steder med thiol-reaktive perler til indfangning og påvisning af S-acylerede proteiner34,35. Sammen har udvekslings- og klikkemibaserede assays givet mere effektive og følsomme metoder til acylationsdetektion og affinitetsrensning til downstream-analyse og har efterfølgende ført til opdagelsen af tusindvis af S-acylerede proteiner8,36.
Udtrykket klikkemi omfatter en gruppe kemiske reaktioner, men refererer oftest til Cu (I) -katalyseret azido-alkyn [3 + 2] cycloadditionsreaktionsmekanisme mellem en alkynylgruppe og en azidogruppe27,28,37. Især i tilfælde af fedtacylering involverer klikkemi påvisning af S-palmitoylering eller N-myristylering ved at inkorporere bio-ortogonal 16-carbonalkynylpalnitat (15-hexadecynoinsyre; 15-HDYA) eller 14-carbonalkynylmyristat (13-tetradecynosyre; 13-TDYA) i celler for at mærke endogent acylerede proteiner28 . Efter cellelyse og immunfældning af proteinet af interesse udføres en klikkemisk reaktion (kovalent kobling mellem en alkyn og etazid) for at binde en affinitetssonde, typisk biotin, til påvisning ved western blot28,37. Alternativt kan klikkemi udføres på det samlede cellelysat, og fedt acylerede proteiner kan affinitet renses til identifikation ved massespektrometri. Den indledende klikkemireaktion med azido-biotin øgede selektiviteten og følsomheden af detektion over en million gange sammenlignet med radioaktivitet2. En anden fordel ved klikkemi er, at den kan kombineres med andre klassiske mærkningsmetoder, såsom pulsjagtanalyse af proteinomsætning ved hjælp af azido-homoalanin til kvantitativ analyse38. Derudover kan fluorescerende sonder anvendes i stedet for biotin eller andre biokemiske sonder, såsom FLAG- eller Myc-tags, for at undersøge proteinlokalisering16,28,39.
På trods af den relative brugervenlighed af klikkemi kan detektion begrænses af den lave opløselighed og potentielle toksicitet ved anvendelse af langkædede frie fedtsyrer i cellekultur40. På trods af præferencen for palmitat under S-acylation for de fleste proteiner har mange undersøgelser især anvendt 18-carbonstearat (17-octadecynsyre – 17-ODYA) snarere end palmitat (15-HDYA) til påvisning af S-acylerede proteiner på grund af dets kommercielle tilgængelighed og relativt lave omkostninger. 17-ODYA er dog meget uopløselig og kræver særlig opmærksomhed, når den bruges. Derudover kan klikkemi kræve en vis nuanceret forberedelse og opbevaring af kemikalier. Heri beskriver protokollen en mærkningsmetode, som optimerer leveringen ved hjælp af forsæbning af fedtsyrer, levering med fedtsyrefri BSA og delipideret føtalt kvægserum (FBS) for at øge opløseligheden og omgå potentielle toksiske virkninger af tilsætning af frie fedtsyrer til celler28. Denne metode virker i en række forskellige celletyper og er endda blevet brugt i levende dyr28.
Direkte tilsætning af fedtsyrer til celler i kultur kan resultere i uopløselighed, udfældning af lipider og lipotoksicitet40. Derfor kan tilsætning af fedtsyrer direkte til celler ikke kun resultere i dårlig cellulær optagelse og lav tilgængelighed af fedtsyremærket, men også et nedsat antal levedygtige celler til downstream-analyse samt aktivering af off-target-veje. Imidlertid involverer mange metaboliske mærkningsprotokoller til påvisning af klikkemi direkte tilsætning af fedtsyrer, og et stort antal palmitoylproteomundersøgelser ved hjælp af klikkemidetektion til dato forsæber sjældent fedtsyreretiketterne eller inkuberer dem med BSA8,36. Det er vigtigt at overveje, at effektiviteten og følsomheden af klikkemidetektion af fedtaclylerede proteiner er afhængig af tilstrækkelig cellulær optagelse af fedtsyreanalogerne. Derfor er det rimeligt at spekulere i, at mange S-acylerede proteiner kan have undgået påvisning i proteomiske undersøgelser på grund af en lav tilgængelighed af fedtsyreetiketterne fra dårlig inkorporering i cellerne, især når den langkædede fedtsyre 17-ODYA blev brugt. 17-ODYA, eller alkynyl-stearat, har været den meget anvendte etiket til flere undersøgelser på grund af dets kommercielle tilgængelighed og dets tidlige anvendelse8,36. Resultaterne af denne protokol viser imidlertid, at forsæbning af 17-ODYA resulterer i den største stigning i påvisningen af S-acylerede proteiner sammenlignet med kortkædede fedtsyrer såsom palmitat eller myristat. Derfor kan gentagelse af disse eksperimenter med forsæbte etiketter give yderligere substrater af S-acylation, der måske tidligere er blevet overset. Yderligere, mens de fleste palmitoylacyltransferaser foretrækker palmitat til S-acylering, har nogle præferencer for andre længder af fedtsyrer, såsom stearat15,38,44. Derudover foretrækker nogle proteiner eller endda specifikke steder i proteiner en fedtsyre frem for en anden15,45. Derfor kan undersøgelser, der anvender 17-ODYA, have en bias mod proteiner S-acyleret med stearat, ikke palmitat, mens de også underrepræsenterer disse proteiner på grund af lavere påvisning.
Den forbedrede metaboliske mærkningseffektivitet for klikkemi er afhængig af forsæbning af lipider og inkubation med FAFBSA-trin samt den aflipiderede FBS. Alle fedtsyrer skal være fuldstændigt forsæbt i KOH uden synlige faste stoffer tilbage, før de fortsætter med inkubation med FAFBSA. Dette kan være et vanskeligt skridt, og timing er afgørende. Når de forsæbte fedtsyrer er gået i opløsning ved 65 °C, tilsættes varm BSA med det samme, da yderligere opvarmning vil forårsage fordampning af DMSO fra fedtsyrerne. Derudover vil den forsæbte etiket begynde at størkne igen, så snart den begynder at afkøle. Derfor skal FAFBSA være varm og tilsættes hurtigt, efter at saltet er blevet opløseligt. Glasreaktionshætteglassene og deres form er vigtige for dette trin. De tillader det forsæbte lipid at være varmt nok til at forblive opløseligt, mens det er køligt nok til at sikre, at FAFBSA ikke størkner. Tilstrækkelig blanding via pipettering er også vigtig på dette trin for at sikre en homogen opløsning til mærkning.
Reagenserne til klikkemi skal opbevares korrekt, typisk med tørremidler eller under N2 – eller Ar-gas ved -20 °C til -80 °C. Manglende acylationssignal eller svagt signal kan skyldes ustabile reagenser, især ældre TBTA- og azidlageropløsninger. Desuden skal man være forsigtig med fluorescerende zidopløsninger, som skal beskyttes mod lys så meget som muligt. Derudover kan det være nødvendigt at teste variabler såsom metode til lipidmangel og mærkningstid for at bestemme de optimale betingelser afhængigt af den anvendte celletype. For eksempel kan neuronale celler have brug for længere mærkningstider, fordi medieændringer og lipidmangel er vanskelige (ikke offentliggjort).
Fordelen ved denne protokol er mest dramatisk, når den anvendes til langkædede fedtsyrer. For kortere kæder bliver stigningen i signalintensiteten mindre dramatisk, men er stadig sandsynligvis beskyttende for cellerne. Mens de foreslåede ændringer vil forbedre proteinacylationsdetektion generelt, betragtes klikkemi stadig som en lipidcentreret metode1, der er begrænset til påvisning af dynamisk, ikke stabilt S-acylerede proteiner1. Andre begrænsninger, der skal overvejes, omfatter kravet om fedtsyremangel for at fremme mærkning og dets relativt begrænsede udvalg af kompatible celletyper sammenlignet med acyl-biotinudveksling (ABE) påvisning af S-acylation16. På trods af disse begrænsninger er detektion af klikkemi hurtigere end de fleste acyludvekslingsassays og er bedre egnet til påvisning af proteiner, der ikke tåler de gentagne proteinudfældningstrin, der kræves til acyludvekslingsassays. Derudover kan denne fremgangsmåde kombineres med samtidig mærkning ved hjælp af andre klikanalyser såsom pulsjagtanalyse38.
Anvendelsen af denne modifikation til metabolisk mærkning til klikkemi øgede den samlede påvisning af acylerede proteiner, især S-acylerede, med en række proteomiske teknikker, der anvendes sammen med klikkemi. Som vist kan fluorogen detektion anvendes som et alternativ til biotin (figur 1)28. Dette er især nyttigt, fordi der ikke er nogen endogent fluorescerende proteiner i cellelysaterne. Derudover kan fluoroforer, der først aktiveres efter klikkemi, anvendes46. Den forsæbte og FAFBSA-bundne fedtsyre til mærkning af klikkemi kan hjælpe med vanskeligheder med at detektere proteiner af interesse på grund af en samlet stigning i mængden af etiket, der er tilgængelig i cellen, og ved at begrænse toksiske virkninger af tilsætning af fedtsyrer direkte til medierne. Det kan også bruges sammen med massespektrometri27 til at øge påvisningen af proteiner med lav overflod, især når det tages sammen med de seneste fremskridt ved hjælp af maskinlæringsalgoritmer, der forhindrer overflødige målinger for at øge følsomheden over for proteiner med lav overflod, i modsætning til eksisterende dataafhængig erhvervelse, der favoriserer påvisning af de mest rigelige proteiner47 . Derudover kan klikkemi kombineres med stabil isotopmærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) og pulsjagtmetoder til fremstilling af kvantificerbare data om dynamisk protein S-acylation27. Endelig har Hannoush-gruppen kombineret klikkemi med nærhedsligeringsassay (PLA) for at muliggøre enkeltcellevisualisering og undersøgelser af subcellulær fordeling af palmitoylerede proteiner43,48.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao blev finansieret af The Ram og Lekha Tumkur Memorial Scholarship gennem Biologisk Institut ved University of Waterloo og Lucy Morrison Memorial Bursary gennem IODE Ontario ud over kandidatforskningsfinansieringen fra University of Waterloo, der omfatter Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award og Graduate Teaching Assistantship. Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Martin-laboratoriet for deres støtte til at forberede dette manuskript, især Stephanie Ryall, Harleen Gill og Sadia Khan, der oprindeligt hjalp med at oprette Martin Lab som forberedelse til disse undersøgelser. Forfatterne vil også gerne takke Dr. Luc Berthiaume for den venlige gave af ctHTT-GFP-konstruktionerne og Dr. Shaun Sanders for kritisk input i forberedelsen af manuskriptet. Figur 3 blev oprettet med BioRender.com.
13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) | Click Chemistry Tools | 1164 | |
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) | Click Chemistry Tools | 1165 | |
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) | Cayman Chemical Company | 90270 | |
30% acrylamide/bis solution 29:1 | Biorad | 1610156 | |
96-well plate reader | Biorad | N/A | |
AFDye 647 azide plus | Click Chemistry Tools | 1482 | |
Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 1610700 | |
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine | Biorad | 12004167 | |
Anti-rabbit Alexa 488 | Invitrogen | A11034 | |
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine | Biorad | 12004166 | |
Biotin Azide | Click Chemistry Tools | 1265 | |
Bis-tris, ultrapure | VWR | 715 | |
Calcium chloride | J.T. Baker | 1332-1 | |
Centrifuge 16,000xg, 4°C | Thermo Scientific | N/A | |
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) | Life Technologies | A3382101 | |
ChemiDoc Imager | Biorad | N/A | |
Copper sulfate (1 mM) | VWR | BDH9312 | |
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate | MP Biomedicals | 102906 | |
Detergent compatible (DC) assay | Biorad | N/A | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR | 0231-500 mL | |
DMEM, 1x | Wisent Inc | 319015CL | |
Ethanol, anhydrous | N/A | N/A | |
Fatty Acid Free BSA | MP Biomedicals | 219989950 | |
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer | Biorad | N/A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483-020 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid | VWR | 5011 | |
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 | VWR | N/A | |
Igepal CA-630 | Alfa Aesar | J61055 | |
Image Lab Software | Biorad | N/A | |
L-glutamine supplement solution | Wisent Inc | 609-065-EL | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | |
Myristic Acid (25 mM) | VWR | M0476-25G | |
Palmitic acid (100 mM) | VWR | P0002-25G | |
Penicillin-Streptomycin, 10x | Wisent Inc | 450201EL | |
Pepstatin A (synthetic) | Enzo Life Sciences | ALX-260-085-M005 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Enzo Life Sciences | ALX-270-184-G005 | |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | VWR | 75801-000 | |
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) | Eusera | EU4 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
Potassium hydroxide | Ward's Science | 470302-100 | |
Rabbit polyclonal antibody to GFP | Eusera | EU1 | |
Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
Sodium pyruvate | Wisent Inc | 600-110-EL | |
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate | Thermo Fisher Scientific | S21378 | |
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) | Soltec Ventures | M115 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin/EDTA | Wisent Inc | 325-043-CL | |
Tween 20 Reagent Grade 1L | VWR | 97062-332 | |
WHEATON NextGen V Vials 3 mL | VWR | 89085-424 |