שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

Summary

המחקר של acylation שומן יש השלכות חשובות אינטראקציות חלבון הסלולר ומחלות. מוצג כאן הוא פרוטוקול שונה כדי לשפר את זיהוי הכימיה קליק של חלבונים acylated שומן, אשר ניתן ליישם בסוגי תאים שונים בשילוב עם בדיקות אחרות, כולל מרדף דופק ספקטרומטריית מסה.

Abstract

אסילציה שומנית, התוספת הקוולנטית של חומצות שומן רוויות למצעי חלבון, חשובה בוויסות מספר עצום של פונקציות תאיות בנוסף להשלכותיה בסרטן ובמחלות ניווניות. ההתפתחויות האחרונות בשיטות זיהוי אסילציה שומנית אפשרו זיהוי יעיל ולא מסוכן של חלבונים עתירי שומן, במיוחד באמצעות שימוש בכימיה של קליקים עם תיוג ביו-אורתוגונלי. עם זאת, זיהוי כימיה קליק יכול להיות מוגבל על ידי מסיסות לקויה והשפעות רעילות פוטנציאליות של הוספת חומצות שומן שרשרת ארוכה לתרבות התא. מתואר כאן היא גישת תיוג עם משלוח ממוטב באמצעות חומצות שומן saponified בשילוב עם BSA ללא חומצות שומן, כמו גם מדיה delipidated, אשר יכול לשפר את הזיהוי של חלבונים acylated שומן קשה לזהות. אפקט זה היה בולט ביותר עם אנלוגי אלקיניל-סטארט, 17-ODYA, אשר היה אנלוגי חומצת השומן הנפוצה ביותר בזיהוי כימיה קליק של חלבונים אציליים. שינוי זה ישפר את התאגדות התאים ויגביר את הרגישות לזיהוי חלבונים מצולק. בנוסף, גישה זו יכולה להיות מיושמת במגוון סוגי תאים בשילוב עם בדיקות אחרות כגון ניתוח מרדף דופק, תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבית התאים, ספקטרומטריית מסה עבור פרופיל כמותי של חלבונים אסילציה שומן.

Introduction

אסילציה שומנית כרוכה בתוספת קוולנטית של חומצות שומן לחלבונים והיא ידועה בחשיבותה בקידום אינטראקציות חלבון-קרום, אך הוכח גם כמקדם אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים קונפורמציה, ומווסת אתרים קטליטיים של אנזימים1,2,3,4,5,6,7 . אצילציה שומנית התגלתה כיעד פוטנציאלי לתרופה במספר עצום של מחלות, כולל זיהום, סרטן, דלקת, ניוון עצבי, שבו הפרעות palmitoylation תועדו8,9,10,10,11,12,13. זה כבר מונע בעיקר על ידי פיתוח של שיטות זיהוי כימיות חדשות, אשר אפשר זיהוי בקנה מידה גדול של מטרות חלבון S-acylated.

אסילציה שומנית יכולה לכלול מגוון רחב של שינויים הכרוכים בתוספת קוולנטית של חומצות שומן רוויות ובלתי רוויות, אך בדרך כלל מתייחס N-myristoylation ו- S-acylation. N-myristoylation מתייחס לתוספת של חומצה מיריסטית לגליצינים N-terminal או בתרגום משותף על פוליפפטידים המתהווה או לאחר תרגום על גליצינים N-מסוף שנחשפו לאחרונה בעקבות מחשוף פרוטאוליטי2,14. N-myristoylation מתרחשת באמצעות קשר אמיד בלתי הפיך. מצד שני, S-acylation מתייחס בדרך כלל לתוספת הפיכה של חומצות שומן ארוכות שרשרת לשאריות ציסטאין באמצעות קשר תיואסטר. הצורה הנפוצה ביותר של שינוי זה כוללת את השילוב של palmitate, ולכן, מכונה בדרך כלל S-palmitoylation, או פשוט palmitoylation11,15. במובנים רבים, S-palmitoylation דומה זרחן. זה דינמי, מוסדר אנזימטית, ומוכיח להיות מאוד מתיחה.

עד העשור האחרון, לימוד אצילות שומן הופרע על ידי שיטות זיהוי מוגבלות, אשר נדרשו רדיואקטיבית שכותרתו חומצות שומן. היו לכך מספר חסרונות, כולל עלות, בעיות בטיחות וזמני זיהוי ארוכים מאוד. בדרך כלל, דקל דקלים טריוטי או יוד שימש לגילוי של S-acylation16. פלמיטט tritiated נדרש תקופות זיהוי ארוכות עם סרט אוטורדיוגרפיה, אשר יכול לקחת שבועות עד חודשים. בעוד [^125I] אנלוגים חומצות שומן iodo קיצרו את זמני הזיהוי, זה הציג סיכון בטיחותי גבוה בהרבה ונדרש ניטור קרוב של בלוטת התריס של הנסיינים. בנוסף, שיטות אלה היו לא כמותיות, ולכן, הגבלת היכולת למדוד palmitoylation דינמי, וגם זמן רב כדי להגדיר ולנקות בשל ציוד מגן אישי נוסף ניטור רדיואקטיבי. לבסוף, תוויות רדיואקטיביות לא היו מתאימות היטב למחקרים פרוטאומיים ובדרך כלל מוגבלות לזיהוי תפוקה נמוכה של חלבונים ספציפיים של עניין. ככל שזוהו יותר מצעים, ובאופן בלתי נמנע זוהו האנזימים המתווכים כל שינוי, היה ברור שנדרשות שיטות זיהוי חדשות 17,18,19,19,20,21. כמעט בו זמנית, מספר שיטות חדשות התעוררו לגילוי חלבונים acylated שומן. הראשון מנצל את ההפיכות והתגובה של קשר thioester של S-acylation. בדיקת חילופי אציל-ביוטין (ABE) מחליפה כימית את פלמיטט בביוטין למשיכת חלבונים S-acylated לאחר מכן באמצעות חרוזי אגרווז אבידין וזיהוי ישיר על ידי כתם ^{מערבי22,23,24}. לאחר מכן, פותחו תיוג ביו-אורתוגונלי של חומצות שומן ותוספת כימוסלקטיבית לתגים או ידיות שכללו את השימוש בקשירת Staudinger ולחץ על כימיה25,26,27,28,29,30,31,32,33 . לבסוף, בדומה ל- ABE, לכידת אציל-שרף בסיוע (RAC) למעשה מחליף אתרים S-acylated עם חרוזים תגובתי תיול ללכידה וזיהוי של חלבונים S-acylated34,35. יחד, הבדיקות המבוססות על החלפה וכימיה של קליקים סיפקו שיטות יעילות ורגישות יותר של גילוי אסילציה וטיהור זיקה לניתוח במורד הזרם, ולאחר מכן הובילו לגילוי אלפי חלבונים S-acylated8,36.

המונח כימיה קליק מקיף קבוצה של תגובות כימיות, אבל בדרך כלל מתייחס Cu(I)-מזורז אזידו-alkyne [3+2] cycloaddition תגובה מנגנון בין קבוצת אלקיניל וקבוצת אזידו227,28,37. במיוחד, במקרה של acylation שומן, כימיה קליק כרוך בזיהוי S-palmitoylation או N-myristylation על ידי שילוב ביו-אורתוגונל 16-פחמן אלקיניל-פלמיטט (15-hexadecynoic חומצה; 15-HDYA) או 14-פחמן אלקיניל-myristate (13-טטראדצינואית חומצה; 13-TDYA), בהתאמה, לתאים לתייג חלבונים אציליים ^{אנדוגניים28} . לאחר תמוגת תאים ואימונופרציפציה של חלבון העניין, תגובה כימית קליק (קישור קוולנטי בין אלקין ואזיד) מבוצעת כדי לאגד גשוש זיקה, בדרך כלל ביוטין, לגילוי על ידי blot ^{המערבי28,37}. לחלופין, כימיה קליק יכול להתבצע על סך lysate התא חלבונים acylated שומן יכול להיות מטוהר לזיהוי על ידי ספקטרומטריית מסה. תגובת הכימיה הראשונית של הקליק עם אזידו-ביוטין הגדילה את הסלקטיביות והרגישות של הזיהוי יותר ממיליון פעמים בהשוואה לרדיואקטיביות2. יתרון נוסף של כימיה קליק הוא שזה יכול להיות משולב עם שיטות תיוג קלאסיות אחרות, כגון ניתוח דופק-מרדף של מחזור חלבון באמצעות אזידו-הומואלנין לניתוח ^כמותי38. בנוסף, ניתן להשתמש בבדיקות פלואורסצנטיות במקום בביוטין או בבדיקות ביוכימיות אחרות, כגון תגי FLAG או Myc, על מנת לבחון לוקליזציה של חלבון16,28,39.

למרות הקלות היחסית של השימוש בכימיה קליק, זיהוי יכול להיות מוגבל על ידי מסיסות נמוכה רעילות פוטנציאלית של שימוש בחומצות שומן ללא שרשרת ארוכה בתרבית ^התא40. בפרט, למרות ההעדפה של פלמיטט במהלך S-acylation עבור רוב החלבונים, מחקרים רבים השתמשו 18-פחמן stearate (17-אוקטדיצינואית חומצה – 17-ODYA) ולא פלמיטט (15-HDYA) לאיתור חלבונים S-acylated בשל הזמינות המסחרית שלה ועלות נמוכה יחסית. עם זאת, 17-ODYA הוא מאוד מסיס ודורש תשומת לב מיוחדת בעת שימוש. בנוסף, כימיה קליק יכול לדרוש כמה הכנה ניואנסים ואחסון של כימיקלים. בזאת, הפרוטוקול מתאר גישה תיוג, אשר מייעל את המסירה באמצעות saponification של חומצות שומן, משלוח עם BSA ללא חומצות שומן, וסרום בקר עוברי delipideded (FBS) כדי להגדיל את המסיסות ולעקוף השפעות רעילות פוטנציאליות של הוספת חומצות שומן חופשיות ^לתאים28. שיטה זו פועלת במגוון סוגי תאים ואף שימשה בבעלי ^חיים28.

Protocol

1. תרבות התא להשלמת DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco) לתרבות תאים, הוסיפו 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1x פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ”מ L-גלוטמין ו-100 מ”מ נתרן פירובט (1% נפח/נפח). צלחת כ 5 x 105 HEK293T תאים / באר של צלחת תרבית רקמות 6 באר לגדול במשך 18 שעות בחממה לחה 37 °C עם 5% CO2 כדי להגיע 75%-80% מפגש. חסך בסרום חומצות שומן כדי להכין מדיית תיוג, הכן את DMEM כאמור (שלב 1.1) ללא 10% FBS. החלף את FBS ב- FBS מצופה פחם של 5% Dextran (DCC-FBS). יש לחמם מראש ל-37°C (50°F) לפני השימוש. שטפו בעדינות את התאים עם תמיסת מלח אחת עם חוצץ פוספט (PBS) בטמפרטורת החדר והחליפו במדיה עם תיוג.הערה: תאי HEK293T מתנתקים מלוחות תרבית רקמות בקלות. יש להקפיד בעת שטיפת תאים והחלפת מדיה. למזער את התסיסה במהלך ההעברה אל האינקובטור וממנו ככל האפשר. החזירו את התאים לחממה של 37 °C עם 5% CO2 ודגרו כ -45 דקות (מינימום 15 דקות יעיל), עד 60 דקות, לפני שתמשיכו עם תיוג מטבולי עם חומצות שומן. 2. הכנה וספוניפיקציה של אנלוגים חומצות שומן הכן את פתרונות המלאי של חומצות שומן אלקיניל מראש על ידי solubilizing ב- DMSO כדי להשיג את הריכוזים הבאים ולאחסן ב -20 °C (60 °F). להפשיר בטמפרטורת החדר לפי הצורך. אחסן את ההכנות לביצועים הטובים ביותר שלהם תחת N2 או Ar.אלקיניל-מיריסטט (13-טטרדצינואית חומצה, 13-TDYA): 25 מ”ראלקיניל-פלמיטט (15-חומצה הקסדצינואית; 15-HDYA): 100 מ”ראלקיניל-סטארט (17-חומצה אוקטדיצינואית; 17-ODYA): 100 מ”ר כדי להכין 20% חומצות שומן ללא BSA (FAFBSA), לשקול 2 גרם של FAFBSA בצינור חד פעמי 50 מ”ל. יש להביא עד 10 מ”ל עם DMEM שחומם מראש (37°C). יש לערבב על-ידי סיבוב מקצה לקצה או על-ידי מערבולת, ומניחים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את FAFBSA. השתמש במסנן 0.2 מיקרומטר כדי לסנן את המדיום. Aliquot בכרכים של כ 1 מ”ל ולאחסן ב -20 °C (60 °F). להפשיר לפי הצורך ולחמם עד 37 °C (50 °F) באמבט מים לפני השימוש. כדי לשפר את המסיסות של חומצת השומן ואנלוגי חומצות שומן, saponify על ידי דגירה עם 20% טוחן עודף של אשלגן הידרוקסיד (KOH) בבקבוקוני תגובה חרוטית זכוכית 3 מ”ל.הערה: בקבוקונים אלה מאפשרים למלח להישאר מסיס תוך הבטחת FAFBSA אינו congeal מן החום הגבוה. השימוש בזכוכית גם מונע מחומצות שומן להידבק לפלסטיק. פיפטה החוצה לפחות 2 μL של חומצת שומן אלקיניל אנלוגי ישירות לתחתית בקבוקון תגובה חרוטי 3 מ”ל. הכן 2 μL של שומנים בדם לכל באר של צלחת 6-well בשימוש (ראה טבלה 1).הערה: בשל הידרופוביות של חומצות שומן, עדיף לצפות את קצה פיפטה על ידי ציור את הנפח הרצוי מספר פעמים לפני חלוקתו לתוך בקבוקון התגובה. לדלל 1 M KOH לריכוזים שווים 20% טוחנת עודף של תווית חומצת השומן אלקיניל (30 מ”מ עבור 13-TDYA ו 120 מ”מ עבור 15-HDYA ו 17-ODYA). פיפטה החוצה כמות שווה של KOH מדולל (1 μL : 1 μL חומצת שומן : KOH) קרוב לתחתית בקבוקון התגובה על קצה הזכוכית, כך נפח מחלק של KOH מתערבב עם חומצת השומן. סגור את המכסה של הבקבוקון והקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות.הערה: התערובת עשויה להתמצק במהירות, במיוחד לאורכים הולכים וגדלים של שרשרת הפחמימנים של חומצת השומן. היזהר לא לשפשף את מוצק (כלומר, לא לערבב על ידי צנרת). מחממים את בקבוקון התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך כ-5 דקות, או ברגע שחומצת השומן משולבת (הפתרון מתבהר).הערה: חומצות שומן עם מספר גבוה יותר של פחמנים וירידה במסיסות, כגון סטארט (17-ODYA), עשויות לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר כדי להשתלב באופן מלא ב- KOH ב 65 °C (65 °F). העלו את הטמפרטורה ל-70 מעלות צלזיוס במידת הצורך. אמבט מים הוא הטוב ביותר. יש לדאוג כי הנוזל אינו מתאדה יותר מדי. לאחר שחומצות השומן נכנסו לתמיסה ולא נותרו מוצקים נראים לעין, פיפטה הקדימה 20% FAFBSA כך שיחס הנפח של חומצות שומן: KOH: FAFBSA הוא 1: 1: 50 כדי להשיג ריכוז סופי של חומצות שומן אלקיניל קשורות BSA 20x. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה. הפתרון נראה בדרך כלל ברור ללא מוצקים גלויים.הערה: בדרך כלל, כל מוצקים קטנים ייכנסו לפתרון לאחר הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לדגור חומצת השומן ו FAFBSA במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).הערה: התווית saponified בשלב זה יציבה מעבר ל -15 דקות.   סה”כ נפח מדיה (mL) Vol. חומצת שומן או חומצת שומן אנלוגית (μL) Vol. KOH (μL) Vol. 20% FAFBSA (μL) סה”כ כרך של תווית סאפוני מצומדת BSA (μL) 4 4 4 200 208 2 2 2 100 104 טבלה 1: יחסי תיוג חומצות שומן סאפוניים. כמויות ניסיוניות של חומצות שומן, KOH, ו- FAFBSA עבור saponification של תווית חומצות שומן על פי נפח המדיה המשמשת. כפקד, חזור על שלב 2.3. עם חומצות שומן ללא תווית אלקין. סמן את התאים עם נפח של 1/20 של חומצת שומן 20x-BSA מצומד ישירות על מדיה רעב (בדרך כלל, 100 μL ב 2 מ”ל מדיה / תאים) כדי להשיג ריכוז סופי של 1% BSA ו 25 מיקרומטר עבור אלקיניל-מיריסטט, או 100 מיקרומטר עבור אלקיניל-פלמיטט ואלקיניל-סטארט.הערה: כדי למזער את כמות ההפרעה הפיזית לתאים המצורפים, צור טיפה בקצה הפיפטה קרוב לפני השטח של המדיה במקום להזרים ישירות למדיה. אם משתמשים במעכבי התאצות, יש להוסיף לפחות 15 דקות לפני חומצות השומן המסומנות. הזמנים עשויים להשתנות בהתאם לתאים או למדכא המשמשים. הומלץ להשתמש בספוניפיקציה לשלב זה גם כן28. לשם השוואה, להוסיף שומנים שאינם saponified על ידי pipetting 2 μL (או שווה ערך נפח saponified) של חומצת שומן ללא תווית ישירות לתוך התקשורת רעב. מחזירים את התאים לאינקובטור ודוללים במשך 3-6 שעות.הערה: ייתכן שיהיה צורך לקבוע תזמון תיוג אופטימלי עבור כל סוג תא או מצב ניסיוני. זמני דגירה ארוכים יותר עלולים להוביל לפירוק חומצות השומן על ידי חמצון β ו/או שילוב בקבוצות שומנים אחרים, כגון פוספוליפידים28. שטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר. קציר וlyse התאים עם 500 μL ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)ללא רדיואימונופרציפציה (RIPA) נטולת רדיואימונופרציפציה (RIPA) מאגר (0.1% SDS, 50 mM N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N-אתנסולפוני (HEPES) pH 7.4, 150 מ”מ נקל, 1% חומר ניקוי לא דנטורטור, 0.5% נתרן דאוקסיכולט, 2 מ”מ MgCl2 עם תוספת טרייה של 1 מ”מ פנילמאתילסולפוניל פלואוריד (PMSF), ו-10 מיקרוגרם/μL Pepstatin A (או קוקטייל מעכב פרוטאז מלא ללא EDTA)) על ידי נדנדת הליסטים למשך 15 דקות ב-4 °C . צנטריפוגה lysates ב 16,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (65 °F). לאסוף את supernatant בצינורות microcentrifuge 1.7 מ”ל ולאחסן ב -20 °C (80 °F) עד מוכן להמשיך עם תגובת לחיצה.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. Lysates יציבים ב -20 °C (65 °F) עד 1 חודש. עם זאת, מומלץ להמשיך עם תגובת הקליק בזמן. לכמת את ריכוזי החלבון באמצעות בדיקה מתאימה לפי פרוטוקול היצרן, כגון בדיקת חומר ניקוי תואמת (DC). 3. לחץ על תגובה על lysates תא הכן את הריאגנטים לכימיה של קליקים. להמיס טריס-(benzyltriazolylmethyl) אמין (TBTA) ב- DMSO עד 2 מ”מ. יש לאחסן באותיות קטנות עם ייבוש בטמפרטורה של עד 20°C למשך עד 2-3 חודשים. מומלץ לאחסן תחת N2 או Ar. להמיס CuSO4 במים ddH2O כדי להשיג 50 mM. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים. ממיסים טריס-קרבוקסיתילפוספין (TCEP) במים ddH2O עד 250 מ”מ. יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) ולבצע דילול טרי של 50 מ”מ רגע לפני תגובת הלחיצה. הכן 2 mM אזיד ב- DMSO. יש לאחסן באותיות קטנות עם ייבוש בטמפרטורה של עד 20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. מומלץ לאחסן תחת N2 או Ar.הערה: זה נצפתה כי המוצרים עם שלוש קבוצות גליקול פוליאתילן או יותר עבדו הכי טוב עם ביוטין. הביאו 50-100 מיקרוגרם של ליסט חלבון בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.7 מ”ל לאותו נפח באמצעות אותו מאגר תמוגה כמו לעיל.הערה: שמור על עוצמת התגובה קטנה ככל האפשר (20-100 μL). הוסף נתרן דודציל גופרתי (SDS) לכל מדגם כדי להשיג ריכוז סופי של 1%. הכן תערובת ראשית של ריאגנטים קליקים כך שהריכוזים הסופיים לאחר התוספת לליסטים הם: 100 מיקרומטר TBTA (מלאי 2 מ”מ), 1 mM CuSO4, (50 מ”מ מלאי) 1 mM TCEP (מלאי 50 מ”מ), ו 100 μM azide בדיקה (2 mM מלאי). שלב פתרונות מלאי בהתאם (ראה טבלה 2).הערה: ההזמנה חשובה. יש לערבב לחלוטין לאחר התוספת של כל רכיב. הוסף אמצעי אחסון מתאימים של תערובת המאסטר לליסטים. מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה. דגירה במשך 30 דקות בחושך באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. להסתיז / לערבב מדי פעם. נפח תגובה כולל (μL) חלבון Vol. (μL) Vol. TBTA (2 מ”מM) (μL) Vol. CuSO4 (50 מ”ר) (μL) Vol. TCEP (50 מ”ר) (μL) גשושית כף אזידו (2 מ”מ) (μL) 50 43 2.5 1 1 2.5 100 86 5 2 2 5 טבלה 2: לחץ על יחסי ריאגנט ונפח חלבון. כרכים ניסיוניים של ריאגנטים כימיים קליק וריכוזים מלאי מקבילים, בנוסף לנפחים של דגימות חלבון. 4. לחץ על תגובה על חלבונים immunoprecipitated לחלופין, ניתן לבצע את תגובת הקליק על חלבונים immunoprecipitated (IP) על או מחוץ לחרוזים.הערה: בדרך כלל, ביצוע לחיצה על החרוזים מוביל לרקע הנמוך ביותר והוא הטוב ביותר בעת בדיקת חלבונים חדשים של עניין. תאים Transfect עבור חלבון העניין, במקרה זה, wildtype myristoylated C-מסוף ציד (HTT) התמזגו GFP (myr-ctHTT-GFP) ו ctHTT-GFP עם תחליף G2A, באמצעות סידן פוספט DNA coprecipitation, כפי שתואר בעבר41. צלחת 2.5 x 105 תאים / גם בלוחות תרבית רקמות 6-well ולגדול בן לילה ~ 70-80% מפגש. הכן את תערובת ה- DNA על ידי הוספת DNA 2.5 מיקרוגרם ב 10 μL עם 99.75 μL מולקולרי כיתה H2O לצינור microcentrifuge 1.7 מ”ל. לאחר מכן, להוסיף 15.25 μL CaCl2 dropwise לתערובת ה- DNA. הוסף תערובת DNA / CaCl2 לצינור נפרד המכיל 125 μL 2x HEPES תמיסת מלח חוצצת (HBS, pH 7.0) באופן טיפה עם ערבוב. הוסף לאט את תערובת הדנ”א/CaCl2/HBS לתאים. לאחר 2-4 שעות, להחליף את התקשורת ולדגור בן לילה. המשך עם תיוג משלבים 1.3-2.8. הכן נפחים שווים של חלבון 500 מיקרוגרם במאגר תמוגה. בצע IP על ידי דגירה עם ארנב אנטי GFP עבור ctHTT-GFP מסתובב לילה ב 4 °C (60 °F). הוסף 15-20 μL חלבון G חרוזים מראש שיווי משקל עם חיץ תמוגה לכל צינור ולאפשר לו להגיב סוף סוף ב 4 °C (60 °F) עבור 3 שעות. לשטוף את החרוזים עם מאגר תמוגה resuspend ב 45 μL 1% SDS 50 mM HEPES חוצץ. מחממים את החרוזים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והופכים את הצינורות או מתסיסים בערך כל 5 דקות. לסובב בקצרה את הצינורות ולחזור 80 °C (80 °F). לאסוף את supernatant המכיל את החלבונים בעוד הדגימות עדיין חמות.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן וניתן לאחסן את הדגימות immunoprecipitated ב- -20 °C (60 °F) או -80 °C (60 °F), אם לא נעשה בה שימוש לכימיה בלחיצה באופן מיידי. אפשר 43 μL של supernatant להגיב עם 7 μL תערובת מאסטר של ריאגנטים קליק. המשך עם התגובה כאמור בשלב 3.2.3. 5. SDS-PAGE וסגירה מערבית עצור את התגובה ואת denature על ידי הוספת 1x מאגר טעינת מדגם המכיל 25 mM dithiothreitol (DTT) וחום ב 95 °C (5 דקות).הערה: ניתן להשתמש בעד 100 מ”מ DTT28. אין להשתמש β-mercaptoethanol עם חלבונים S-acylated כפי שהוא יכול הידרוליזה קשרים thioester ולהסיר את אנלוגי חומצת שומן קליק. סובבו בקצרה את הדגימות. הפרד את החלבונים עם SDS-PAGE על ג’ל פוליאקרילאמיד, בכפילויות.הערה: שני ג’לים נדרשים לטיפול אלקליין עם KOH כדי לאשר את נוכחותם של קשרים thioester. אם משתמשים בבדיקת אזיד פלואורסצנטית, ניתן לזהות את האצילות בג’ל או לאחר ההעברה באמצעות ערוץ העירור המצוין. העברה לקרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) (מופעל במתנול ושטוף ב- ddH2O – 5 דקות כל אחד) עם מנגנון העברה יבש למחצה ב 25 V, 1.0 A (קבוע) במשך 30 דקות. לאחר שטיפה קצרה של הממברנות עם ddH2O, להשרות קרום לשכפל אחד ב 0.1 M KOH במתנול / מים (9:1 v / v) והשני ב 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 במתנול / מים (9:1 v / v) כמו בקרה לא אלקליין במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה. לשטוף את הממברנות לזמן קצר במים ddH2O, ואחריו 6 פעמים של 5 דקות שטיפות PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween 20).הערה: יש לשטוף היטב. לחסום את הקרומים לילה ב 5% מאגר חסימת חלב רזה (1x PBS, 0.1% Tween20). 6. לבצע כתם מערבי כאשר מצוין, בדיקה עם Streptavidin מתויג פלואורסצנטית (1:5000) ובקרת טעינה, רודמין נגד GAPDH (1:5000) ב 5% BSA חסימת חוצץ (0.01% SDS, 1x PBS, 0.1% Tween20) בטמפרטורת החדר במשך 45-60 דקות עם נדנדה עדינה, בחושך. בדוק את כתם החלבון immunoprecipitated תחילה עם נוגדן אנטי GFP ראשוני ב 5% מאגר חסימת חלב רזה, ולאחר מכן עם נוגדנים משניים מתאימים ב 5% BSA כמו בשלב 6.1. לשטוף את הממברנות במשך 5 דקות PBS-T (1x PBS, 0.1% Tween20) בסך הכל ארבעה חזרות ולשטוף עם מים ddH2O לפני הדמיה.

Representative Results

ניתן לדמיין את ההבדל ביעילות התיוג בין חומצות שומן אלקיניל סאפוניות ולא-סאפוניות (שאינן sap) לזיהוי כימיה של קליקים ולהשוות אותות לעוצמת האות של חלבונים עתירי שומן באמצעות כתם מערבי (איור 1). השפעה ניכרת נצפתה עם אורך הולך וגדל של שרשראות אציל. בתאים המסומנים באלקיניל-סטארט (alk-stear), סאפוניפיקציה של חומצת השומן ואספקה עם BSA לתיוג מטבולי הגבירו באופן דרסטי את הזיהוי של אות חלבון S-acylated באמצעות כימיה וזיהוי קליקים על ידי בדיקת אזידו פלואורסצנטית (איור 1, מימין), דבר המצביע על עלייה כוללת בשילוב התאי של תווית חומצת השומן אלקיניל. לעומת זאת, לא נצפתה הבדל ניכר בתאים שטופלו בחומצת השומן הקצרה והמסיסה ביותר, אלקיניל-מיריסטט (אלקיניל-מאייר; 13-חומצה טטרדצינואית או 13-TDYA). תאים המסומנים באלקיניל-פלמיטט (איור 1, אמצע) הראו עלייה בינונית בתווית בהשוואה לאלקיניל-מיריסטט (13-TDYA), אך פחות מאלקיניל-סטארט. חשוב לציין, טיפול בממברנות PVDF עם 0.1 M KOH הסיר במידה רבה את תוויות חומצות השומן מתאים שנדגרו עם אלקיניל-פלמיטט ואלקיניל-סטארט, המאשר כי רוב האות היה באמצעות קשר אסתר או תיאסטר (איור 1, אמצע וימין, לוחות תחתון). כצפוי, השילוב של אלקיניל-מיריסטט היה בעיקר עמיד בפני אלקלי (איור 1, שמאל, לוחות תחתונים), בשל החיבור של מיריסטט לחלבונים באמצעות קשר אמיד. איור 2 מדגים את הרב-תכליתיות והרגישות של כימיית קליקים כדי לזהות אצילות שומנית של חלבונים אימונו-פחתיים. תאי HEK293T הודבקו עם ציד C-מסוף מיריסטוylated (HTT) הותך GFP (myr-ctHTT-GFP) ומסומן עם אלקיניל-מיריסטט, כפי שתואר בעבר18. לאחר immunoprecipitation, ctHTT-GFP שוחרר מן החרוזים והיה נתון לכימיה קליק לצד lysates. לא רק שהמיריסטוילציה של wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP זוהתה באימונופרציפיטים, אלא שהיא זוהתה מאוד בליסטים, בעוד המוטציה G2A חסמה לחלוטין מיריסטוילציה של ctHTT-GFP (איור 2). איור 1: זיהוי חלבונים עתירי שומן באמצעות כימיה של קליקים. תאי HEK293T דוגרו עם חומצות השומן המצוינות ישירות (ללא SAP) או בעקבות סאפוניפיקציה (sap) ודגרה עם חלבון הנושא BSA, כמתואר בפרוטוקול 2.1-2.7. חומצות שומן אלקיניל קושרו אזיד פלואורסצנטי על ידי חשיפת 100 מיקרוגרם של ליסטים חלבון ללחוץ על כימיה, מופרדים על ידי SDS-PAGE, והועברו לממברנות PVDF. לאחר טיפול עם 0.1 M Tris pH 7.0 או 0.1 M KOH, כדי להפוך את קשרים thioester, acylation שומן זוהה באמצעות אזיד פלואורסצנטי. GAPDH שימש כפקד טעינה; רודמין נגד GAPDH (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: זיהוי של ctHTT-GFP N-myristoylated באמצעות כימיה של קליקים. תאי HEK293T הועברו עם C-סופני חתוך (ct) וצורה myristoylatable של HTT (myr-ctHTT-GFP) ומסומנים עם אלקיניל-מיריסטט. צורה שאינה ניתנת למיריסטואולציה עם הגליצין החיוני שהוחלף באלנין נכללה (G2A). לאחר קציר וליזה, ctHTT-GFP היה immunoprecipitated באמצעות עז אנטי GFP. Lysates היו נתונים לתגובת כימיה קליק (משמאל) כמו גם immunoprecipitates לאחר שחרור מן החרוזים. Myristoylation זוהה באמצעות Streptavidin Alexa 680 (SA680). GFP זוהה באמצעות ארנב אנטי GFP בשילוב עם אנטי ארנב Alexa 488. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ערכת זרימת עבודה של פרוטוקול ניסיוני. חלוקה לרמות של זרימת עבודה של השלבים הניסיוניים העיקריים בפרוטוקול. מספר נקודות נרשמות כאשר הפרוטוקול עשוי להיות מושהה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

תוספת ישירה של חומצות שומן לתאים בתרבית יכולה לגרום לחוסר מסיסות, משקעים של שומנים, ו lipotoxicity40. כתוצאה מכך, הוספת חומצות שומן ישירות לתאים עלולה לא רק לגרום לספיגה תאית ירודה וזמינות נמוכה של תווית חומצת השומן, אלא גם ירידה במספר התאים המעשיים לניתוח במורד הזרם, כמו גם הפעלה של מסלולים מחוץ למטרה. עם זאת, פרוטוקולי תיוג מטבוליים רבים לזיהוי כימיית קליקים כרוכים בתוספת ישירה של חומצות שומן ומספר רב של מחקרי פלמיטויל-פרוטאום באמצעות זיהוי כימיה קליק עד כה לעתים רחוקות saponify תוויות חומצות שומן או לדגור אותם עם ^BSA8,36. חשוב לקחת בחשבון את העובדה כי היעילות והרגישות של זיהוי כימיה קליק של חלבונים שומן-acylated תלויים ספיגה תאית מספקת של אנלוגים חומצות שומן. לכן, סביר להניח כי חלבונים S-acylated רבים אולי נמלטו גילוי במחקרים פרוטאומיים בשל זמינות נמוכה של תוויות חומצות שומן משילוב לקוי לתוך התאים, במיוחד כאשר חומצת שומן שרשרת ארוכה יותר 17-ODYA שימש. 17-ODYA, או אלקיניל-סטארט, היה התווית הנפוצה של בחירה עבור מספר מחקרים בשל הזמינות המסחרית שלה ואת השימוש המוקדם ^שלה8,36. עם זאת, התוצאות של פרוטוקול זה ממחישות כי סאפוניפיקציה של 17-ODYA גורמת לעלייה הגדולה ביותר בזיהוי חלבונים S-acylated, בהשוואה לחומצות שומן קצרות יותר בשרשרת כגון פלמיטט או מיריסטט. לכן, חזרה על ניסויים אלה עם תוויות saponified עשוי להניב מצעים נוספים של S-acylation כי ייתכן שהתעלמו בעבר. יתר על כן, בעוד רוב palmitoyl acyltransferases מעדיפים palmitate עבור S-acylation, חלקם יש העדפות עבור אורכים אחרים של חומצות שומן כגון stearate15,38,44. בנוסף, חלבונים מסוימים או אפילו אתרים ספציפיים בתוך חלבונים מעדיפים חומצת שומן אחת על פני עוד ^15,45. לכן, מחקרים באמצעות 17-ODYA עשוי להיות הטיה כלפי חלבונים S-acylated עם stearate, לא פלמיטט, תוך ייצוג חסר חלבונים אלה עקב גילוי נמוך יותר.

יעילות התיוג המטבולית המשופרת לכימיה של קליקים מסתמכת על סאפוניפיקציה של שומנים בדם ודגרה עם שלבי FAFBSA, כמו גם FBS המופרז. כל חומצות השומן חייב להיות saponified לחלוטין ב- KOH ללא מוצקים גלויים שנותרו לפני שתמשיך עם דגירה עם FAFBSA. זה יכול להיות צעד קשה ותזמון הוא קריטי. לאחר שחומצות השומן הספוניות נכנסו לתמיסה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, הוסיפו BSA חם מיד מכיוון שחימום נוסף יגרום לאידוי של DMSO מחומצות השומן. בנוסף, התווית saponified יתחיל להתמצק מחדש ברגע שהוא מתחיל להתקרר. לכן, FAFBSA חייב להיות חם והוסיף במהירות לאחר המלח הפך מסיס. בקבוקוני תגובת הזכוכית, וצורתם חשובים לשלב זה. הם מאפשרים את השומנים saponified להיות חם מספיק כדי להישאר מסיס, בעוד קריר מספיק כדי להבטיח כי FAFBSA אינו congeal. ערבוב מספיק באמצעות צינורות חשוב גם בשלב זה כדי להבטיח פתרון הומוגני לתיוג.

הריאגנטים לכימיה של קליקים צריכים להיות מאוחסנים כראוי, בדרך כלל עם חומרי ייבוש או תחת גז _N2 או Ar ב -20 °C (60 °F) עד -80 °C (80 °F). חוסר אות acylation או אות חלש עשוי להיות בגלל ריאגנטים לא יציבים, במיוחד TBTA ישן יותר ופתרונות מלאי azide. יתר על כן, יש לנקוט בזהירות עם פתרונות מלאי אזיד פלואורסצנטיים, אשר צריך להיות מוגן מפני אור ככל האפשר. בנוסף, משתנים כגון שיטה של מניעת שומנים בדם וזמן תיוג ייתכן שיהיה צורך לבדוק כדי לקבוע את התנאים האופטימליים בהתאם לסוג התא המשמש. לדוגמה, תאים עצביים עשויים להזדקק זמני תיוג ארוכים יותר כי שינויים בתקשורת ומחסור בשומנים הם קשים (לא פורסם).

היתרון של פרוטוקול זה הוא הדרמטי ביותר כאשר נעשה שימוש בחומצות שומן ארוכות שרשרת. עבור שרשראות קצרות יותר, העלייה בעוצמת האות הופכת לפחות דרמטית, אך עדיין צפויה להגן על התאים. בעוד השינויים המוצעים ישפרו את זיהוי האצילציה חלבון באופן כללי, כימיה קליק עדיין נחשב שיטה ממוקדת ^{שומנים1} מוגבלת לזיהוי של חלבונים דינמיים, לא S-acylated ^יציב1. מגבלות אחרות שיש לקחת בחשבון כוללות את הדרישה של חסך חומצות שומן כדי לקדם תיוג, ואת הטווח המוגבל יחסית של סוגי תאים תואמים בהשוואה לחילופי אציל ביוטין (ABE) זיהוי של S-acylation16. למרות מגבלות אלה, זיהוי כימיה קליק הוא מהיר יותר מאשר רוב בדיקות חילופי אציל והוא מתאים יותר לזיהוי חלבונים שאינם סובלים את שלבי משקעי חלבון חוזרים ונשנים הנדרשים לבדיקות חילופי אציל. בנוסף, גישה זו יכולה להיות משולבת עם תיוג סימולטני באמצעות בדיקות קליק אחרות כגון ניתוח מרדף ^דופק38.

השימוש בשינוי זה עבור תיוג מטבולי לכימיה קליק הגביר את הזיהוי הכולל של חלבונים acylated, במיוחד S-acylated, עם מגוון של טכניקות פרוטאומיות המשמשות בשילוב עם כימיה קליק. כפי שניתן לראות, זיהוי פלואורוגני יכול לשמש כחלופה לביוטין (איור 1)²⁸. זה שימושי במיוחד כי אין חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגני בתא lysates. בנוסף, פלואורופורים המופעלים רק לאחר כימיה קליק ניתן ^{להשתמש46}. חומצת השומן הכפופה ל-FAFBSA לתיוג כימיה בלחיצה יכולה לסייע בקשיים בזיהוי חלבונים בעלי עניין עקב עלייה כוללת בכמות התווית הזמינה בתא ועל ידי הגבלת ההשפעות הרעילות של הוספת חומצות שומן ישירות לתקשורת. זה יכול גם להיות מנוצל בשילוב עם ספקטרומטריית ^מסה27 כדי להגביר את הזיהוי של חלבונים בשפע נמוך, במיוחד כאשר נלקח יחד עם ההתקדמות האחרונה באמצעות אלגוריתמים למידת מכונה המונעים מדידות מיותרות כדי להגביר את הרגישות לחלבונים בשפע נמוך, בניגוד לרכישה תלויית נתונים קיימת המעדיפה זיהוי של החלבונים הנפוצים ^ביותר47 . בנוסף, ניתן לשלב כימיה של קליק עם תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבית התאים (SILAC) ושיטות מרדף דופק כדי לייצר נתונים הניתנים לכימות על חלבון דינמי S-acylation27. לבסוף, קבוצת Hannoush שילבה כימיה קליק עם בדיקת קשירת קרבה (PLA) כדי לאפשר הדמיה של תא יחיד ובדיקות לתוך הפצה תת תאית של חלבונים palmitoylated43,48.

Materials

13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)	Click Chemistry Tools	1164
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)	Click Chemistry Tools	1165
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)	Cayman Chemical Company	90270
30% acrylamide/bis solution 29:1	Biorad	1610156
96-well plate reader	Biorad	N/A
AFDye 647 azide plus	Click Chemistry Tools	1482
Ammonium persulfate (APS)	Biorad	1610700
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine	Biorad	12004167
Anti-rabbit Alexa 488	Invitrogen	A11034
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine	Biorad	12004166
Biotin Azide	Click Chemistry Tools	1265
Bis-tris, ultrapure	VWR	715
Calcium chloride	J.T. Baker	1332-1
Centrifuge 16,000xg, 4°C	Thermo Scientific	N/A
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)	Life Technologies	A3382101
ChemiDoc Imager	Biorad	N/A
Copper sulfate (1 mM)	VWR	BDH9312
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate	MP Biomedicals	102906
Detergent compatible (DC) assay	Biorad	N/A
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	VWR	0231-500 mL
DMEM, 1x	Wisent Inc	319015CL
Ethanol, anhydrous	N/A	N/A
Fatty Acid Free BSA	MP Biomedicals	219989950
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer	Biorad	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483-020
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane	Pall Life Sciences	BSP0161
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid	VWR	5011
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2	VWR	N/A
Igepal CA-630	Alfa Aesar	J61055
Image Lab Software	Biorad	N/A
L-glutamine supplement solution	Wisent Inc	609-065-EL
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Methanol	VWR	BDH1135
Myristic Acid (25 mM)	VWR	M0476-25G
Palmitic acid (100 mM)	VWR	P0002-25G
Penicillin-Streptomycin, 10x	Wisent Inc	450201EL
Pepstatin A (synthetic)	Enzo Life Sciences	ALX-260-085-M005
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Enzo Life Sciences	ALX-270-184-G005
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	VWR	75801-000
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)	Eusera	EU4
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane	Pall Life Sciences	BSP0161
Potassium hydroxide	Ward's Science	470302-100
Rabbit polyclonal antibody to GFP	Eusera	EU1
Sodium chloride	VWR	0241-1KG
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500
Sodium pyruvate	Wisent Inc	600-110-EL
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate	Thermo Fisher Scientific	S21378
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)	Click Chemistry Tools	1061
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)	Soltec Ventures	M115
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Trypsin/EDTA	Wisent Inc	325-043-CL
Tween 20 Reagent Grade 1L	VWR	97062-332
WHEATON NextGen V Vials 3 mL	VWR	89085-424