Studien av fettakylering har viktige implikasjoner i cellulære proteininteraksjoner og sykdommer. Presentert her er en modifisert protokoll for å forbedre klikkkjemideteksjon av fettakylerte proteiner, som kan brukes i ulike celletyper og kombinert med andre analyser, inkludert pulsjakt og massespektrometri.
Fettakylering, den kovalente tilsetningen av mettede fettsyrer til proteinsubstrater, er viktig for å regulere et utall cellulære funksjoner i tillegg til dets implikasjoner i kreft og nevrodegenerative sykdommer. Nylige utviklinger i fettakyleringsdeteksjonsmetoder har gjort det mulig med effektiv og ikke-farlig deteksjon av fettakylerte proteiner, spesielt ved bruk av klikkkjemi med bio-ortogonal merking. Imidlertid kan klikkkjemideteksjon begrenses av dårlig løselighet og potensielle toksiske effekter av å legge til lange kjedefettsyrer til cellekulturen. Beskrevet her er en merking tilnærming med optimalisert levering ved hjelp av saponified fettsyrer i kombinasjon med fettsyrefrie BSA, samt delipidated media, som kan forbedre påvisning av vanskelig å oppdage fett acylated proteiner. Denne effekten ble mest uttalt med alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, som har vært den mest brukte fettsyreanalogen i klikkkjemideteksjon av acylaterte proteiner. Denne modifikasjonen vil forbedre cellulær inkorporering og øke følsomheten for acylert proteindeteksjon. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes i en rekke celletyper og kombineres med andre analyser som pulsjaktanalyse, stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekultur og massespektrometri for kvantitativ profilering av fettakylerte proteiner.
Fettakylering innebærer kovalent tilsetning av fettsyrer til proteiner og er kjent for sin betydning for å fremme proteinmembraninteraksjoner, men har også vist seg å fremme proteinproteininteraksjoner, konformasjonsendringer og regulere katalytiske steder av enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fettakylering har dukket opp som et potensielt legemiddelmål i et utall sykdommer, inkludert infeksjon, kreft, betennelse og nevrodegenerasjon, hvor forstyrrelser i palmitoylering er dokumentert8,9,10,11,12,13. Dette har først og fremst blitt ansporet av utviklingen av nye kjemiske deteksjonsmetoder, som gjorde det mulig å identifisere S-acylerte proteinmål i stor skala.
Fettakylering kan omfatte en rekke modifikasjoner som involverer kovalent tilsetning av mettede og umettede fettsyrer, men refererer vanligvis til N-myristoylering og S-akriylering. N-myristoylering refererer til tilsetning av myristisk syre til N-terminal glyciner enten co-translationally på nascent polypeptider eller post-translationally på nylig eksponerte N-terminal glyciner etter proteolytisk spalting2,14. N-myristoylering skjer gjennom et irreversibel midtbinding. På den annen side refererer S-akriylering vanligvis til den reversible tilsetningen av lange kjedefettsyrer til cysteinrester via en thioesterbinding. Den vanligste formen for denne modifikasjonen inkluderer inkorporering av palmitat og er derfor ofte referert til som S-palmitoylering, eller bare palmitoylering11,15. På mange måter ligner S-palmitoylering fosforylering. Det er dynamisk, enzymatisk regulert, og viser seg å være svært gjennomførbart.
Frem til det siste tiåret ble studier av fettakylering hindret av begrensede deteksjonsmetoder, som krevde radioaktivt merkede fettsyrer. Dette hadde flere ulemper, inkludert kostnader, sikkerhetsproblemer og svært lange deteksjonstider. Vanligvis ble enten tritiated eller jodet palmitate brukt til påvisning av S-acylering16. Tritiated palmitate krevde lange deteksjonsperioder med autoradiografifilm, noe som kan ta uker til måneder. Mens [125I] iodo-fettsyreanaloger forkortet deteksjonstider, presenterte den en mye høyere sikkerhetsrisiko og krevde tett skjoldbruskovervåking av eksperimenter. I tillegg var disse metodene ikke-kvantitative, og begrenset derfor evnen til å måle dynamisk palmitoylering, og også tidkrevende å sette opp og rydde opp på grunn av ekstra personlig verneutstyr og radioaktiv overvåking. Til slutt var radioaktive etiketter ikke godt egnet for proteomiske studier og vanligvis begrenset til lav gjennomstrømningsdeteksjon av spesifikke proteiner av interesse. Etter hvert som flere substrater ble oppdaget, og uunngåelig enzymene som formidler hver modifikasjon ble identifisert, var det klart at nye deteksjonsmetoder var nødvendige17,18,19,20,21. Nesten samtidig oppstod flere nye metoder for påvisning av fettakylerte proteiner. Den første utnytter reversibilitet og reaktivitet av thioester binding av S-akkylering. Acyl-biotin utveksling (ABE) analysen kjemisk erstatter palmitate med biotin for etterfølgende pulldown av S-acylert proteiner ved hjelp av avidin agarose perler og direkte deteksjon av vestlige blot22,23,24. Deretter ble bio-ortogonal merking av fettsyrer og kjemoktivt tillegg til tagger eller håndtak utviklet som inkluderte bruk av Staudinger-ligation og klikkkjemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Til slutt, i likhet med ABE, erstatter acylharpiksassistert fangst (RAC) i hovedsak S-acylerte steder med tiolreaktive perler for fangst og påvisning av S-acylaterte proteiner34,35. Sammen har de utvekslings- og klikkkjemibaserte analysene gitt mer effektive og sensitive metoder for acyleringsdeteksjon og affinitetsrensing for nedstrømsanalyse og har senere ført til oppdagelsen av tusenvis av S-acylerte proteiner8,36.
Begrepet klikkkjemi omfatter en gruppe kjemiske reaksjoner, men refererer oftest til Cu(I)-katalysert azido-alkyne [3+2] cycloaddition reaksjonsmekanisme mellom en alkynylgruppe og en azidogruppe27,28,37. Spesielt når det gjelder fettakylering, innebærer klikkkjemi påvisning av S-palmitoylering eller N-myristylering ved å inkorporere bio-ortogonal 16-karbon alkynyl-palmitate (15-heksadecynsyre; 15-HDYA) eller 14-karbon alkynyl-myristate (henholdsvis 13-tetradecynoinsyre; 13-TDYA), i celler for å merke endogene acylerte proteiner28 . Etter cellelys og immunoprecipitation av proteinet av interesse, utføres en klikkkjemireaksjon (kovalente kobling mellom en alkyne og en azide) for å binde en affinitetssonde, vanligvis biotin, for deteksjon av vestlig blot28,37. Alternativt kan klikkkjemi utføres på totalcellelyset, og fettakylerte proteiner kan affinitet renses for identifisering ved massespektrometri. Den første klikkkjemireaksjonen med azido-biotin økte selektiviteten og følsomheten til deteksjon over en million ganger sammenlignet med radioaktivitet2. En annen fordel med klikkkjemi er at den kan kombineres med andre klassiske merkingsmetoder, for eksempel pulsjaktanalyse av proteinomsetning ved hjelp av azido-homoalanin for kvantitativ analyse38. I tillegg kan fluorescerende sonder brukes i stedet for biotin eller andre biokjemiske sonder, for eksempel FLAG- eller Myc-koder, for å undersøke proteinlokalisering16,28,39.
Til tross for den relative brukervennligheten av klikkkjemi, kan deteksjon begrenses av lav løselighet og potensiell toksisitet ved bruk av lange kjedefrie fettsyrer i cellekulturen40. Spesielt, til tross for preferansen av palmitat under S-acylering for de fleste proteiner, har mange studier brukt 18-karbonstearatet (17-oktadecynsyre – 17-ODYA) i stedet for palmitat (15-HDYA) for å oppdage S-acylerte proteiner på grunn av kommersiell tilgjengelighet og relativt lave kostnader. Imidlertid er 17-ODYA veldig uoppløselig og krever spesiell oppmerksomhet når den brukes. I tillegg kan klikkkjemi kreve litt nyansert tilberedning og lagring av kjemikalier. Her beskriver protokollen en merkingstilnærming, som optimaliserer levering ved hjelp av saponering av fettsyrer, levering med fettsyrefri BSA og delipidert fosterbovinserum (FBS) for å øke løseligheten og omgå potensielle toksiske effekter av å legge til frie fettsyrer til celler28. Denne metoden fungerer i en rekke celletyper og har til og med blitt brukt i levende dyr28.
Direkte tilsetning av fettsyrer til celler i kultur kan føre til uoppløselighet, utfelling av lipider og lipotoksisitet40. Følgelig kan tilsetning av fettsyrer direkte til celler ikke bare resultere i dårlig cellulært opptak og lav tilgjengelighet av fettsyreetiketten, men også et redusert antall levedyktige celler for nedstrømsanalyse, samt aktivering av off-target veier. Imidlertid innebærer mange metabolske merkingsprotokoller for klikkkjemideteksjon direkte tilsetning av fettsyrer og et stort antall palmitoylproteomestudier ved hjelp av klikkkjemideteksjon til dags dato, og beskytter sjelden fettsyreetikettene eller inkuberer dem med BSA8,36. Det er viktig å vurdere det faktum at effektiviteten og følsomheten til klikkkjemideteksjon av fettakylerte proteiner er avhengige av tilstrekkelig cellulært opptak av fettsyreanalogene. Derfor er det rimelig å spekulere i at mange S-acylerte proteiner kan ha unnsluppet deteksjon i proteomiske studier på grunn av lav tilgjengelighet av fettsyreetikettene fra dårlig inkorporering i cellene, spesielt når den lengre kjedefettsyren 17-ODYA ble brukt. 17-ODYA, eller alkynyl-stearate, har vært den mye brukte etiketten for flere studier på grunn av kommersiell tilgjengelighet og tidlig bruk8,36. Resultatene av denne protokollen viser imidlertid at saponering av 17-ODYA resulterer i den største økningen i påvisning av S-acylaterte proteiner, sammenlignet med kortere kjedefettsyrer som palmitate eller myristate. Derfor kan gjentakelse av disse eksperimentene med saponifiserte etiketter gi ytterligere substrater av S-akriylering som tidligere kan ha blitt oversett. Videre, mens de fleste palmitoyl acyltransferaser foretrekker palmitat for S-acylering, har noen preferanser for andre lengder av fettsyrer som stearate15,38,44. I tillegg foretrekker noen proteiner eller til og med spesifikke steder i proteiner en fettsyre fremfor en annen15,45. Derfor kan studier som bruker 17-ODYA ha en skjevhet mot proteiner S-acylert medstearat, ikke palmitat, samtidig som de underreguleres på grunn av lavere deteksjon.
Den forbedrede metabolske merkingseffektiviteten for klikkkjemi er avhengig av saponering av lipider og inkubasjon med FAFBSA-trinn, samt de delipiderte FBS. Alle fettsyrer må være fullstendig saponert i KOH uten synlige faste stoffer igjen før du fortsetter med inkubasjon med FAFBSA. Dette kan være et vanskelig skritt, og timing er avgjørende. Etter at de saponifiserte fettsyrene har gått i oppløsning ved 65 °C, tilsett varm BSA umiddelbart, da ytterligere oppvarming vil føre til fordampning av DMSO fra fettsyrene. I tillegg vil den saponifiserte etiketten begynne å størkne igjen så snart den begynner å avkjøles. Derfor må FAFBSA være varm og tilsatt raskt etter at saltet er blitt oppløselig. Glassreaksjonsflaskene og deres form er viktige for dette trinnet. De tillater den saponifiserte lipiden å være varm nok til å forbli løselig, mens den er kjølig nok til å sikre at FAFBSA ikke congeal. Tilstrekkelig blanding via pipettering er også viktig på dette trinnet for å sikre en homogen løsning for merking.
Reagensene for klikkkjemi må lagres riktig, vanligvis med tørkemidler eller under N2 – eller Ar-gass ved -20 °C til -80 °C. Mangel på acyleringssignal eller svakt signal kan skyldes ustabile reagenser, spesielt eldre TBTA- og azide-lagerløsninger. Videre må det tas hensyn til fluorescerende azide lagerløsninger, som må beskyttes mot lys så mye som mulig. I tillegg kan det hende at variabler som metode for lipidmangel og merketid må testes for å bestemme de optimale forholdene avhengig av hvilken type celle som brukes. For eksempel kan nevronceller trenge lengre merketider fordi medieforandringer og lipidmangel er vanskelige (upublisert).
Fordelen med denne protokollen er mest dramatisk når den brukes til lengre kjede fettsyrer. For kortere kjeder blir økningen i signalintensiteten mindre dramatisk, men er fortsatt sannsynlig beskyttende for cellene. Mens de foreslåtte modifikasjonene vil forbedre proteinakyleringsdeteksjon generelt, anses klikkkjemi fortsatt som en lipidsentrisk metode1 som er begrenset til påvisning av dynamisk, ikke stabilt S-acylerte proteiner1. Andre begrensninger å vurdere inkluderer kravet om fettsyremangel for å fremme merking, og det relativt begrensede spekteret av kompatible celletyper sammenlignet med acyl-biotinutveksling (ABE) påvisning av S-acylering16. Til tross for disse begrensningene er klikkkjemideteksjon raskere enn de fleste acylutvekslingsanalyser og er bedre egnet for påvisning av proteiner som ikke tolererer de gjentatte proteinutfellingstrinnene som kreves for acylutvekslingsanalyser. I tillegg kan denne tilnærmingen kombineres med samtidig merking ved hjelp av andre klikkanalyser som pulsjaktanalyse38.
Bruken av denne modifikasjonen for metabolsk merking for klikkkjemi økte den totale påvisning av acylaterte proteiner, spesielt S-acylert, med en rekke proteomiske teknikker som brukes i forbindelse med klikkkjemi. Som vist kan fluorogen deteksjon brukes som et alternativ til biotin (figur 1)28. Dette er spesielt nyttig fordi det ikke er noen endogent fluorescerende proteiner i cellen lyser. I tillegg kan fluoroforer som bare aktiveres etter klikkkjemi brukes46. Den saponifiserte og FAFBSA-bundne fettsyren for klikkkjemimerking kan hjelpe med vanskeligheter med å oppdage proteiner av interesse på grunn av en generell økning i mengden etikett som er tilgjengelig i cellen og ved å begrense toksiske effekter av å legge til fettsyrer direkte til media. Det kan også brukes sammen med massespektrometri27 for å øke påvisning av proteiner med lav overflod, spesielt når det tas sammen med den nylige utviklingen ved hjelp av maskinlæringsalgoritmer som forhindrer overflødige målinger for å øke følsomheten for proteiner med lav overflod, i motsetning til eksisterende dataavhengig oppkjøp som favoriserer deteksjon av de mest tallrike proteinene47 . I tillegg kan klikkkjemi kombineres med stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekultur (SILAC) og pulsjaktmetoder for å produsere kvantifiserbare data om dynamisk protein S-acylering27. Til slutt har Hannoush-gruppen kombinert klikkkjemi med nærhetsligasjonsanalyse (PLA) for å tillate encellet visualisering og undersøkelser i subcellulær fordeling av palmitoylerte proteiner43,48.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao ble finansiert av The Ram og Lekha Tumkur Memorial Scholarship gjennom Institutt for biologi ved University of Waterloo, og Lucy Morrison Memorial Bursary gjennom IODE Ontario, i tillegg til forskningsfinansiering fra University of Waterloo bestående av Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award og Graduate Teaching Assistantship. Forfatterne vil takke alle medlemmer av Martin-laboratoriet for deres støtte til å forberede dette manuskriptet, spesielt Stephanie Ryall, Harleen Gill og Sadia Khan som i utgangspunktet hjalp til med å sette opp Martin Lab som forberedelse til disse studiene. Forfatterne vil også takke Dr. Luc Berthiaume for den slags gave av ctHTT-GFP-konstruksjonene og Dr. Shaun Sanders for kritiske innspill i forberedelsen av manuskriptet. Figur 3 ble opprettet med BioRender.com.
13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) | Click Chemistry Tools | 1164 | |
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) | Click Chemistry Tools | 1165 | |
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) | Cayman Chemical Company | 90270 | |
30% acrylamide/bis solution 29:1 | Biorad | 1610156 | |
96-well plate reader | Biorad | N/A | |
AFDye 647 azide plus | Click Chemistry Tools | 1482 | |
Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 1610700 | |
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine | Biorad | 12004167 | |
Anti-rabbit Alexa 488 | Invitrogen | A11034 | |
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine | Biorad | 12004166 | |
Biotin Azide | Click Chemistry Tools | 1265 | |
Bis-tris, ultrapure | VWR | 715 | |
Calcium chloride | J.T. Baker | 1332-1 | |
Centrifuge 16,000xg, 4°C | Thermo Scientific | N/A | |
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) | Life Technologies | A3382101 | |
ChemiDoc Imager | Biorad | N/A | |
Copper sulfate (1 mM) | VWR | BDH9312 | |
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate | MP Biomedicals | 102906 | |
Detergent compatible (DC) assay | Biorad | N/A | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR | 0231-500 mL | |
DMEM, 1x | Wisent Inc | 319015CL | |
Ethanol, anhydrous | N/A | N/A | |
Fatty Acid Free BSA | MP Biomedicals | 219989950 | |
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer | Biorad | N/A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483-020 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid | VWR | 5011 | |
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 | VWR | N/A | |
Igepal CA-630 | Alfa Aesar | J61055 | |
Image Lab Software | Biorad | N/A | |
L-glutamine supplement solution | Wisent Inc | 609-065-EL | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | |
Myristic Acid (25 mM) | VWR | M0476-25G | |
Palmitic acid (100 mM) | VWR | P0002-25G | |
Penicillin-Streptomycin, 10x | Wisent Inc | 450201EL | |
Pepstatin A (synthetic) | Enzo Life Sciences | ALX-260-085-M005 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Enzo Life Sciences | ALX-270-184-G005 | |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | VWR | 75801-000 | |
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) | Eusera | EU4 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
Potassium hydroxide | Ward's Science | 470302-100 | |
Rabbit polyclonal antibody to GFP | Eusera | EU1 | |
Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
Sodium pyruvate | Wisent Inc | 600-110-EL | |
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate | Thermo Fisher Scientific | S21378 | |
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) | Soltec Ventures | M115 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin/EDTA | Wisent Inc | 325-043-CL | |
Tween 20 Reagent Grade 1L | VWR | 97062-332 | |
WHEATON NextGen V Vials 3 mL | VWR | 89085-424 |