Studien av fettacylation har viktiga konsekvenser i cellulära proteininteraktioner och sjukdomar. Här presenteras ett modifierat protokoll för att förbättra klickkemidetektering av fettacylerade proteiner, som kan appliceras i olika celltyper och kombineras med andra analyser, inklusive pulsjakt och masspektrometri.
Fettacylation, den kovalenta tillsatsen av mättade fettsyror till proteinsubstrat, är viktig för att reglera en myriad av cellulära funktioner utöver dess konsekvenser vid cancer och neurodegenerativa sjukdomar. Den senaste utvecklingen inom fettacylationsdetekteringsmetoder har möjliggjort effektiv och icke-farlig detektion av fettacylerade proteiner, särskilt genom användning av klickkemi med bioortogonal märkning. Klickkemidetektering kan dock begränsas av den dåliga lösligheten och potentiella toxiska effekterna av att tillsätta långkedjiga fettsyror till cellkulturen. Här beskrivs en märkningsmetod med optimerad leverans med förtvålade fettsyror i kombination med fettsyrafri BSA, samt delipiderade medier, vilket kan förbättra detekteringen av svårupptäckta fettacylerade proteiner. Denna effekt var mest uttalad med alkynyl-stearatanalogen, 17-ODYA, som har varit den vanligaste fettsyraanalogen vid klickkemidetektering av acylerade proteiner. Denna modifiering kommer att förbättra cellulär inkorporering och öka känsligheten för acyleerad proteindetektering. Dessutom kan detta tillvägagångssätt tillämpas i en mängd olika celltyper och kombineras med andra analyser såsom pulsjaktanalys, stabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling och masspektrometri för kvantitativ profilering av fettacylaterade proteiner.
Fettacylation innebär kovalent tillsats av fettsyror till proteiner och är välkänt för sin betydelse för att främja protein-membraninteraktioner men har också visat sig främja protein-proteininteraktioner, konformationsförändringar och reglera katalytiska platser för enzymer1,2,3,4,5,6,7 . Fettacylation har uppstått som ett potentiellt läkemedelsmål i en myriad av sjukdomar, inklusive infektion, cancer, inflammation och neurodegeneration, där störningar i palmitoylering har dokumenterats8,9,10,11,12,13. Detta har främst drivits på av utvecklingen av nya kemiska detektionsmetoder, vilket möjliggjorde storskalig identifiering av S-acylerade proteinmål.
Fettacylation kan innefatta en mängd olika modifieringar som involverar kovalent tillsats av mättade och omättade fettsyror, men hänvisar vanligtvis till N-myristoylering och S-acylering. N-myristoylering avser tillsats av myristinsyra till N-terminala glyciner antingen samöversättningellt på begynnande polypeptider eller post-translationellt på nyligen exponerade N-terminala glyciner efter proteolytisk klyvning2,14. N-myristoylering sker genom en irreversibel amidbindning. Å andra sidan hänvisar S-acylation typiskt till den reversibla tillsatsen av långkedjiga fettsyror till cysteinrester via en tioesterbindning. Den vanligaste formen av denna modifiering innefattar införlivandet av palmitat och kallas därför vanligen S-palmitoylering, eller helt enkelt palmitoylering11,15. På många sätt liknar S-palmitoylering fosforylering. Det är dynamiskt, enzymatiskt reglerat och visar sig vara mycket lätthanterligt.
Fram till det senaste decenniet hindrades studier av fettacylation av begränsade detektionsmetoder, vilket krävde radioaktivt märkta fettsyror. Detta hade flera nackdelar, inklusive kostnad, säkerhetsproblem och mycket långa detektionstider. Vanligtvis användes antingen tritierad eller joderad palmitat för detektion av S-acylation16. Tritierad palmitat krävde långa detektionsperioder med autoradiografifilm, vilket kan ta veckor till månader. Medan [125I] jodfettsyraanaloger förkortade detektionstiderna, presenterade det en mycket högre säkerhetsrisk och krävde noggrann sköldkörtelövervakning av experimenter. Dessutom var dessa metoder icke-kvantitativa, vilket begränsade förmågan att mäta dynamisk palmitoylering och också tidskrävande att installera och städa upp på grund av extra personlig skyddsutrustning och radioaktiv övervakning. Slutligen var radioaktiva etiketter inte väl lämpade för proteomiska studier och vanligtvis begränsade till detektering av specifika proteiner av intresse. När fler substrat detekterades och oundvikligen enzymerna som förmedlar varje modifiering identifierades, var det klart att nya detektionsmetoder krävdes17,18,19,20,21. Nästan samtidigt uppstod flera nya metoder för detektion av fettacylaterade proteiner. Den första utnyttjar reversibiliteten och reaktiviteten hos tioesterbindningen av S-acylation. Analysen av acyl-biotinutbyte (ABE) ersätter kemiskt palmitat med biotin för efterföljande neddragning av S-acylerade proteiner med användning av avidinagarospärlor och direkt detektion av western blot22,23,24. Därefter utvecklades bio-ortogonal märkning av fettsyror och kemoselektiv tillsats till taggar eller handtag som inkluderade användningen av Staudinger-ligeringen och klickkemi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Slutligen, i likhet med ABE, ersätter acylhartsassisterad infångning (RAC) i huvudsak S-acylerade platser med tiolreaktiva pärlor för infångning och detektion av S-acylerade proteiner34,35. Tillsammans har utbytes- och klickkemibaserade analyser gett effektivare och känsligare metoder för acylationsdetektion och affinitetsrening för nedströmsanalys och har därefter lett till upptäckten av tusentals S-acylerade proteiner8,36.
Termen klickkemi omfattar en grupp kemiska reaktioner, men hänvisar oftast till Cu (I) -katalyserad azido-alkyn [3 + 2] cykloadditionsreaktionsmekanism mellan en alkynylgrupp och en azidogrupp27,28,37. I synnerhet vid fettacylation innebär klickkemi detektion av S-palmitoylering eller N-myristylering genom att införliva bioortogonal 16-kolalkynylpalmitat (15-hexadecynosyra; 15-HDYA) respektive 14-kolalkynyl-myristat (13-tetradecynosyra; 13-TDYA) i celler för att märka endogent acylaterade proteiner28 . Efter celllys och immunutfällning av proteinet av intresse utförs en klickkemireaktion (kovalent koppling mellan en alkyn och en azid) för att binda en affinitetssond, typiskt biotin, för detektion av western blot28,37. Alternativt kan klickkemi utföras på det totala celllysatet och fettacylaterade proteiner kan affinitet renas för identifiering genom masspektrometri. Den initiala klickkemireaktionen med azido-biotin ökade selektiviteten och känsligheten för detektion över en miljon gånger jämfört med radioaktivitet2. En annan fördel med klickkemi är att den kan kombineras med andra klassiska märkningsmetoder, såsom pulsjaktanalys av proteinomsättning med azido-homoalanin för kvantitativ analys38. Dessutom kan fluorescerande sonder användas istället för biotin eller andra biokemiska sonder, såsom FLAG- eller Myc-taggar, för att undersöka proteinlokalisering16,28,39.
Trots den relativa användarvänligheten hos klickkemi kan detektionen begränsas av den låga lösligheten och den potentiella toxiciteten vid användning av långkedjiga fria fettsyror i cellodling40. I synnerhet, trots att palmitat föredras under S-acylation för majoriteten av proteinerna, har många studier använt 18-kolstearat (17-oktadecynosyra – 17-ODYA) snarare än palmitat (15-HDYA) för att detektera S-acylerade proteiner på grund av dess kommersiella tillgänglighet och relativt låga kostnad. 17-ODYA är dock mycket olöslig och kräver särskild uppmärksamhet när den används. Dessutom kan klickkemi kräva viss nyanserad beredning och lagring av kemikalier. Här beskriver protokollet en märkningsmetod som optimerar leveransen med hjälp av förtvålning av fettsyror, leverans med fettsyrafri BSA och delipiderat fetalt bovint serum (FBS) för att öka lösligheten och kringgå potentiella toxiska effekter av att tillsätta fria fettsyror till celler28. Denna metod fungerar i en mängd olika celltyper och har även använts i levande djur28.
Direkt tillsats av fettsyror till celler i odling kan resultera i olöslighet, utfällning av lipider och licotoxicitet40. Följaktligen kan tillsats av fettsyror direkt till celler inte bara resultera i dåligt cellulärt upptag och låg tillgänglighet av fettsyraetiketten, utan också ett minskat antal livskraftiga celler för nedströms analys, liksom aktivering av off-target-vägar. Många metaboliska märkningsprotokoll för klickkemidetektering involverar emellertid direkt tillsats av fettsyror och ett stort antal palmitoylproteomstudier med klickkemidetektering hittills förtvålning av fettsyrorna eller inkuberar dem med BSA8,36. Det är viktigt att överväga det faktum att effektiviteten och känsligheten hos klickkemidetektering av fettacylerade proteiner är beroende av tillräckligt cellulärt upptag av fettsyraanalogerna. Därför är det rimligt att spekulera i att många S-acylerade proteiner kan ha undgått detektion i proteomiska studier på grund av en låg tillgänglighet av fettsyraetiketterna från dålig inkorporering i cellerna, särskilt när den längre kedjefettsyran 17-ODYA användes. 17-ODYA, eller alkynylstearat, har varit den allmänt använda etiketten för flera studier på grund av dess kommersiella tillgänglighet och dess tidiga användning8,36. Resultaten av detta protokoll visar emellertid att förtvålning av 17-ODYA resulterar i den största ökningen av detektionen av S-acylerade proteiner, jämfört med kortkedjiga fettsyror såsom palmitat eller myristat. Därför kan upprepning av dessa experiment med förtvålade etiketter ge ytterligare substrat för S-acylation som tidigare kan ha förbisetts. Vidare, medan de flesta palmitoylacyltransferaser föredrar palmitat för S-acylering, har vissa preferenser för andra längder av fettsyror såsom stearat15,38,44. Dessutom föredrar vissa proteiner eller till och med specifika platser inom proteiner en fettsyra framför en annan15,45. Därför kan studier som använder 17-ODYA ha en bias mot proteiner S-acylerade med stearat, inte palmitat, samtidigt som de underrepre representerar dessa proteiner på grund av lägre detektion.
Den förbättrade metaboliska märkningseffektiviteten för klickkemi är beroende av förtvålning av lipider och inkubation med FAFBSA-steg, liksom den avgränsade FBS. Alla fettsyror måste vara fullständigt förtvålade i KOH utan synliga fasta ämnen kvar innan inkubation med FAFBSA fortsätter. Detta kan vara ett svårt steg och tidpunkten är avgörande. Efter att de förtvålade fettsyrorna har gått i lösning vid 65 ° C, tillsätt varmt BSA omedelbart eftersom ytterligare uppvärmning kommer att orsaka avdunstning av DMSO från fettsyrorna. Dessutom börjar den förtvålade etiketten stelna igen så snart den börjar svalna. Därför måste FAFBSA vara varm och tillsättas snabbt efter att saltet har blivit lösligt. Glasreaktionsflaskorna och deras form är viktiga för detta steg. De tillåter den förtvålade lipiden att vara tillräckligt varm för att förbli löslig, medan den är tillräckligt sval för att säkerställa att FAFBSA inte kongeal. Tillräcklig blandning via pipettering är också viktigt i detta steg för att säkerställa en homogen lösning för märkning.
Reagenserna för klickkemi måste förvaras på rätt sätt, vanligtvis med torkmedel eller under N2 – eller Ar-gas vid -20 °C till -80 °C. Brist på acylationssignal eller svag signal kan bero på instabila reagenser, särskilt äldre TBTA- och azidlagerlösningar. Dessutom måste man vara försiktig med fluorescerande azidlagerlösningar, som måste skyddas från ljus så mycket som möjligt. Dessutom kan variabler som metod för lipidbrist och märkningstid behöva testas för att bestämma de optimala förhållandena beroende på vilken typ av cell som används. Till exempel kan neuronala celler behöva längre märkningstider eftersom medieförändringar och lipidbrist är svåra (opublicerade).
Fördelen med detta protokoll är mest dramatisk när den används för långkedjiga fettsyror. För kortare kedjor blir ökningen av signalintensiteten mindre dramatisk, men är fortfarande sannolikt skyddande för cellerna. Medan de föreslagna modifieringarna kommer att förbättra proteinacylationsdetekteringen i allmänhet, anses klickkemi fortfarande vara en lipidcentrerad metod1 som är begränsad till detektion av dynamiskt, inte stabilt S-acylerade proteiner1. Andra begränsningar att beakta är kravet på fettsyrabrist för att främja märkning och dess relativt begränsade antal kompatibla celltyper jämfört med detektionen av acyl-biotinutbyte (ABE) av S-acylation16. Trots dessa begränsningar är klickkemidetektering snabbare än de flesta acylutbytesanalyser och är bättre lämpad för detektion av proteiner som inte tolererar de upprepade proteinutfällningsstegen som krävs för acylutbytesanalyser. Dessutom kan denna metod kombineras med samtidig märkning med hjälp av andra klickanalyser som pulsjaktanalys38.
Användningen av denna modifiering för metabolisk märkning för klickkemi ökade den totala detekteringen av acylerade proteiner, särskilt S-acylerade, med en mängd proteomiska tekniker som används i samband med klickkemi. Som framgår kan fluorogen detektion användas som ett alternativ till biotin (figur 1)28. Detta är särskilt användbart eftersom det inte finns några endogent fluorescerande proteiner i celllysaterna. Dessutom kan fluoroforer som endast aktiveras efter klickkemi användas46. Den förtvålade och FAFBSA-bundna fettsyran för klickkemimärkning kan hjälpa till med svårigheter att upptäcka proteiner av intresse på grund av en övergripande ökning av mängden etikett som finns tillgänglig i cellen och genom att begränsa toxiska effekter av att tillsätta fettsyror direkt till media. Det kan också användas tillsammans med masspektrometri27 för att öka detektionen av proteiner med låg förekomst, särskilt tillsammans med den senaste tidens framsteg med hjälp av maskininlärningsalgoritmer som förhindrar redundanta mätningar för att öka känsligheten för proteiner med låg överflöd, i motsats till befintligt databeroende förvärv som gynnar detektion av de vanligaste proteinerna47 . Dessutom kan klickkemi kombineras med stabil isotopmärkning med aminosyror i cellodling (SILAC) och pulsjaktmetoder för att producera kvantifierbara data om dynamiskt protein S-acylation27. Slutligen har Hannoush-gruppen kombinerat klickkemi med närhetsligeringsanalys (PLA) för att möjliggöra encellsvisualisering och undersökningar av subcellulär fördelning av palmitoylerade proteiner43,48.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Science and Engineering Research Council (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao finansierades av The Ram and Lekha Tumkur Memorial Scholarship genom Biologiska institutionen vid University of Waterloo och Lucy Morrison Memorial Bursary genom IODE Ontario, förutom forskarforskningsfinansieringen från University of Waterloo som omfattar Graduate Research Studentship (50503-11072), Science Graduate Award och Graduate Teaching Assistantship. Författarna vill tacka alla medlemmar i Martin-laboratoriet för deras stöd i att förbereda detta manuskript, särskilt Stephanie Ryall, Harleen Gill och Sadia Khan som hjälpte till att initialt inrätta Martin Lab som förberedelse för dessa studier. Författarna vill också tacka Dr. Luc Berthiaume för den vänliga gåvan av ctHTT-GFP-konstruktionerna och Dr Shaun Sanders för kritisk input i utarbetandet av manuskriptet. Figur 3 skapades med BioRender.com.
13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM) | Click Chemistry Tools | 1164 | |
15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM) | Click Chemistry Tools | 1165 | |
17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM) | Cayman Chemical Company | 90270 | |
30% acrylamide/bis solution 29:1 | Biorad | 1610156 | |
96-well plate reader | Biorad | N/A | |
AFDye 647 azide plus | Click Chemistry Tools | 1482 | |
Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 1610700 | |
Anti-GAPDH hFAB Rhodamine | Biorad | 12004167 | |
Anti-rabbit Alexa 488 | Invitrogen | A11034 | |
Anti-Tubulin hFAB Rhodamine | Biorad | 12004166 | |
Biotin Azide | Click Chemistry Tools | 1265 | |
Bis-tris, ultrapure | VWR | 715 | |
Calcium chloride | J.T. Baker | 1332-1 | |
Centrifuge 16,000xg, 4°C | Thermo Scientific | N/A | |
Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS) | Life Technologies | A3382101 | |
ChemiDoc Imager | Biorad | N/A | |
Copper sulfate (1 mM) | VWR | BDH9312 | |
Deoxycholic acid sodium salt monohydrate | MP Biomedicals | 102906 | |
Detergent compatible (DC) assay | Biorad | N/A | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR | 0231-500 mL | |
DMEM, 1x | Wisent Inc | 319015CL | |
Ethanol, anhydrous | N/A | N/A | |
Fatty Acid Free BSA | MP Biomedicals | 219989950 | |
Fast Blot Turbo Semi-dry transfer | Biorad | N/A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483-020 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid | VWR | 5011 | |
Humidified Incubator at 37°C and 5% CO2 | VWR | N/A | |
Igepal CA-630 | Alfa Aesar | J61055 | |
Image Lab Software | Biorad | N/A | |
L-glutamine supplement solution | Wisent Inc | 609-065-EL | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
Methanol | VWR | BDH1135 | |
Myristic Acid (25 mM) | VWR | M0476-25G | |
Palmitic acid (100 mM) | VWR | P0002-25G | |
Penicillin-Streptomycin, 10x | Wisent Inc | 450201EL | |
Pepstatin A (synthetic) | Enzo Life Sciences | ALX-260-085-M005 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Enzo Life Sciences | ALX-270-184-G005 | |
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4 | VWR | 75801-000 | |
Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified) | Eusera | EU4 | |
FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane | Pall Life Sciences | BSP0161 | |
Potassium hydroxide | Ward's Science | 470302-100 | |
Rabbit polyclonal antibody to GFP | Eusera | EU1 | |
Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
Sodium pyruvate | Wisent Inc | 600-110-EL | |
Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate | Thermo Fisher Scientific | S21378 | |
Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM) | Click Chemistry Tools | 1061 | |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM) | Soltec Ventures | M115 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Trypsin/EDTA | Wisent Inc | 325-043-CL | |
Tween 20 Reagent Grade 1L | VWR | 97062-332 | |
WHEATON NextGen V Vials 3 mL | VWR | 89085-424 |