Summary

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

Published: July 06, 2021
doi:

Summary

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Abstract

Un contrôle fiable de l’expression génique dans les cellules de mammifères nécessite des outils avec un changement de pli élevé, un faible bruit et des fonctions de transfert d’entrée en sortie déterminées, quelle que soit la méthode utilisée. Pour atteindre cet objectif, les systèmes d’expression génique optogénétique ont attiré beaucoup d’attention au cours de la dernière décennie pour le contrôle spatio-temporel des niveaux de protéines dans les cellules de mammifères. Cependant, la plupart des circuits existants contrôlant l’expression des gènes induits par la lumière varient dans l’architecture, sont exprimés à partir de plasmides et utilisent un équipement optogénétique variable, ce qui crée un besoin d’explorer la caractérisation et la normalisation des composants optogénétiques dans les lignées cellulaires stables. Ici, l’étude fournit un pipeline expérimental de construction, d’intégration et de caractérisation fiables de circuits géniques pour contrôler l’expression génique inductible par la lumière dans les cellules de mammifères, en utilisant un circuit optogénétique à rétroaction négative comme exemple de cas. Les protocoles illustrent également comment la normalisation de l’équipement optogénétique et des régimes lumineux peut révéler de manière fiable les caractéristiques du circuit génique telles que le bruit d’expression des gènes et l’ampleur de l’expression des protéines. Enfin, cet article peut être utile pour les laboratoires peu familiers avec l’optogénétique qui souhaitent adopter une telle technologie. Le pipeline décrit ici devrait s’appliquer à d’autres circuits optogénétiques dans les cellules de mammifères, permettant une caractérisation et un contrôle plus fiables et détaillés de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel, protéomique et, en fin de compte, phénotypique dans les cellules de mammifères.

Introduction

À l’instar d’autres disciplines de l’ingénierie, la biologie synthétique vise à normaliser les protocoles, permettant d’utiliser des outils aux fonctions hautement reproductibles pour explorer des questions pertinentes pour les systèmes biologiques1,2. Un domaine de la biologie synthétique où de nombreux systèmes de contrôle ont été construits est le domaine de la régulation de l’expression des gènes3,4. Le contrôle de l’expression génique peut cibler à la fois les niveaux de protéines et la variabilité (bruit ou coefficient de variation, CV = σ/μ, mesuré comme l’écart-type par rapport à la moyenne), qui sont des caractéristiques cellulaires cruciales en raison de leur rôle dans les états cellulaires physiologiques et pathologiques5,6,7,8. De nombreux systèmes synthétiques capables de contrôler les niveaux de protéines et le bruit4,9,10,11,12 ont été conçus, créant des opportunités de normalisation des protocoles à travers les outils.

Un nouvel ensemble d’outils capables de contrôler les réseaux de gènes qui a récemment émergé est l’optogénétique, permettant l’utilisation de la lumière pour contrôler l’expression des gènes13,14,15,16,17. Semblables à leurs prédécesseurs chimiques, les circuits géniques optogénétiques peuvent être introduits dans n’importe quel type de cellule, allant des bactéries aux mammifères, permettant l’expression de tout gène d’intérêt en aval18,19. Cependant, en raison de la génération rapide de nouveaux outils optogénétiques, de nombreux systèmes ont émergé qui varient dans l’architecture des circuits génétiques, le mécanisme d’expression (par exemple, l’intégration à base de plasmides par rapport à l’intégration virale) et l’équipement de contrôle fournissant de la lumière11,16,20,21,22,23,24,25 . Par conséquent, cela laisse place à la normalisation des caractéristiques optogénétiques telles que la construction et l’optimisation des circuits géniques, la méthode d’utilisation du système (par exemple, l’intégration par rapport à l’expression transitoire), les outils expérimentaux utilisés pour l’induction et l’analyse des résultats.

Pour progresser dans la normalisation des protocoles optogénétiques dans les cellules de mammifères, ce protocole décrit un pipeline expérimental pour concevoir des systèmes optogénétiques dans les cellules de mammifères en utilisant un circuit de gène à rétroaction négative (NF) intégré dans les cellules HEK293 (lignée cellulaire du rein embryonnaire humain) à titre d’exemple. NF est un système idéal pour démontrer la normalisation car il est très abondant26,27,28 dans la nature, ce qui permet d’ajuster les niveaux de protéines et de minimiser le bruit. En bref, nf permet un contrôle précis de l’expression des gènes par un répresseur réduisant sa propre expression suffisamment rapidement, limitant ainsi tout changement par rapport à un état stable. L’état d’équilibre peut être modifié par un inducteur qui inactive ou élimine le répresseur pour permettre plus de production de protéines jusqu’à ce qu’un nouvel état d’équilibre soit atteint pour chaque concentration d’inducteur. Récemment, un système optogénétique NF a été créé qui peut produire une réponse dynamique à grande échelle de l’expression des gènes, maintenir un faible bruit et répondre aux stimuli lumineux, ce qui permet un contrôle spatial de l’expression des gènes11. Ces outils, connus sous le nom de tuners inductibles par la lumière (LITers), ont été inspirés par des systèmes antérieurs qui permettaient le contrôle de l’expression génique dans les cellules vivantes4,10,29,30 et ont été intégrés de manière stable dans les lignées cellulaires humaines pour assurer un contrôle à long terme de l’expression des gènes.

Ici, en utilisant le LITer comme exemple, un protocole est décrit pour créer des circuits de gènes sensibles à la lumière, induire l’expression des gènes avec un appareil à plaque lumineuse (LPA, un matériel d’induction optogénétique)31, et analyser les réponses des lignées cellulaires modifiées et contrôlables optogénétiquement aux stimuli lumineux personnalisés. Ce protocole permet aux utilisateurs d’utiliser les outils LITer pour n’importe quel gène fonctionnel qu’ils souhaitent explorer. Il peut également être adapté à d’autres systèmes optogénétiques avec diverses architectures de circuits (par exemple, rétroaction positive, régulation négative, etc.) en intégrant les méthodes et l’équipement optogénétique décrits ci-dessous. Semblables à d’autres protocoles de biologie synthétique, les enregistrements vidéo et les protocoles optogénétiques décrits ici peuvent être appliqués dans des études unicellulaires dans divers domaines, y compris, mais sans s’y limiter, la biologie du cancer, le développement embryonnaire et la différenciation tissulaire.

Protocol

1. Conception de circuits génétiques Sélectionner les composants génétiques à combiner en un seul circuit génique/plasmide (p. ex., motifs de séquence d’intégration de l’ADN de mammifère32, éléments sensibles à la lumière33 ou gènes fonctionnels34). À l’aide de tout logiciel de génie génétique et/ou de clonage moléculaire, stockez les séquences d’ADN pour une utilisation et une référence ultérieures…

Representative Results

L’assemblage du circuit génique et la génération de lignées cellulaires stables dans cet article étaient basés sur des cellules HEK-293 modifiées commerciales contenant un site FRT unique et stable transcriptionnellement actif (Figure 1). Les circuits géniques ont été construits en vecteurs qui avaient des sites FRT dans le plasmide, permettant l’intégration Flp-FRT dans le génome cellulaire HEK-293. Cette approche ne se limite pas aux cellules Flp-In, car les sites FRT peuve…

Discussion

Les lecteurs de cet article peuvent avoir un aperçu des étapes essentielles à la caractérisation des circuits de gènes optogénétiques (ainsi que d’autres systèmes d’expression génique), y compris 1) la conception, la construction et la validation de circuits de gènes; 2) l’ingénierie cellulaire pour l’introduction de circuits géniques dans des lignées cellulaires stables (p. ex., recombinaison Flp-FRT); 3) l’induction des cellules modifiées avec une plate-forme à base de lumière telle que le LPA…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier le laboratoire Balázsi pour ses commentaires et suggestions, le Dr Karl P. Gerhardt et le Dr Jeffrey J. Tabor de nous avoir aidés à construire le premier LPA, et le Dr Wilfried Weber pour avoir partagé les plasmides LOV2-degron. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R35 GM122561 et T32 GM008444]; Le Centre Laufer de biologie physique et quantitative; et une bourse d’études supérieures en sciences et en génie de la défense nationale (NDSEG). Financement de la redevance pour le libre accès : NIH [R35 GM122561].

Contributions de l’auteur : M.T.G. et G.B. ont conçu le projet. M.T.G., D.C. et L.G., ont effectué les expériences. M.T.G., D.C., L.G. et G.B. ont analysé les données et préparé le manuscrit. G.B. et M.T.G. ont supervisé le projet.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site

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Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).

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