JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Pålitelig prosjektering og kontroll av stabile optogenetiske genkretser i pattedyrceller

Published: July 06, 2021
doi:
10.3791/62109
, , ,
1Biomedical Engineering Department,Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology,Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

Summary

Pålitelig kontroll av lysresponsive pattedyrceller krever standardisering av optogenetiske metoder. Mot dette målet skisserer denne studien en rørledning av genkretskonstruksjon, celleteknikk, optogenetisk utstyrsoperasjon og verifikasjonsanalyser for å standardisere studiet av lysindusert genuttrykk ved hjelp av en negativ-feedback optogenetisk genkrets som en casestudie.

Abstract

Pålitelig genuttrykkskontroll i pattedyrceller krever verktøy med høy foldeendring, lav støy og bestemte input-to-output overføringsfunksjoner, uavhengig av metoden som brukes. Mot dette målet har optogenetiske genuttrykkssystemer fått mye oppmerksomhet det siste tiåret for romlig kontroll av proteinnivåer i pattedyrceller. Imidlertid varierer de fleste eksisterende kretser som kontrollerer lysindusert genuttrykk i arkitektur, uttrykkes fra plasmider, og bruker variabelt optogenetisk utstyr, noe som skaper et behov for å utforske karakterisering og standardisering av optogenetiske komponenter i stabile cellelinjer. Her gir studien en eksperimentell rørledning av pålitelig genkretskonstruksjon, integrasjon og karakterisering for å kontrollere lys-inducible genuttrykk i pattedyrceller, ved hjelp av en negativ feedback optogenetisk krets som eksempel. Protokollene illustrerer også hvordan standardisering av optogenetisk utstyr og lysregimer på en pålitelig måte kan avdekke genkretsfunksjoner som genuttrykksstøy og proteinuttrykksstørrelse. Til slutt kan dette papiret være til nytte for laboratorier som ikke er kjent med optogenetikk som ønsker å ta i bruk slik teknologi. Rørledningen som er beskrevet her, bør søke om andre optogenetiske kretser i pattedyrceller, noe som gir mer pålitelig, detaljert karakterisering og kontroll av genuttrykk ved transkripsjons-, proteomisk og til slutt fenotypisk nivå i pattedyrceller.

Introduction

I likhet med andre ingeniørdisipliner har syntetisk biologi som mål å standardisere protokoller, slik at verktøy med svært reproduserbare funksjoner kan brukes til å utforske spørsmål som er relevante for biologiske systemer1,2. Et domene i syntetisk biologi der mange kontrollsystemer er bygget er området genuttrykksregulering3,4. Genuttrykkskontroll kan målrette både proteinnivåer og variasjonsevne (støy eller variasjonskoeffisient, CV = σ/μ, målt som standardavviket over gjennomsnittet), som er avgjørende cellulære egenskaper på grunn av deres roller i fysiologiske og patologiske cellulære tilstander5,6,7,8. Mange syntetiske systemer som kan kontrollere proteinnivåer og støy4,9,10,11,12 er utviklet, noe som skaper muligheter til å standardisere protokoller på tvers av verktøy.

Et nytt sett med verktøy som kan kontrollere gennettverk som nylig har dukket opp er optogenetikk, slik at bruk av lys for å kontrollere genuttrykk13,14,15,16,17. I likhet med deres kjemiske forgjengere kan optogenetiske genkretser innføres i enhver celletype, alt fra bakterier til pattedyr, noe som tillater uttrykk for ethvert nedstrøms gen av interesse18,19. På grunn av den raske generasjonen av nye optogenetiske verktøy har det imidlertid oppstått mange systemer som varierer i genetisk kretsarkitektur, uttrykksmekanisme (f.eks. plasmidbasert kontra viral integrasjon) og lysforsyningskontrollutstyr11,16,20,21,22,23,24,25 . Derfor gir dette rom for standardisering av optogenetiske funksjoner som genkretskonstruksjon og optimalisering, metode for systemutnyttelse (f.eks. integrasjon vs. forbigående uttrykk), eksperimentelle verktøy som brukes til induksjon og analyse av resultater.

For å gjøre fremskritt med å standardisere optogenetiske protokoller i pattedyrceller, beskriver denne protokollen en eksperimentell rørledning for å konstruere optogenetiske systemer i pattedyrceller ved hjelp av en negativ feedback (NF) genkrets integrert i HEK293-celler (human embryonal nyrecellelinje) som eksempel. NF er et ideelt system for å demonstrere standardisering siden det er svært rikelig26,27,28 i naturen, slik at proteinnivåer kan justeres og støyminimering kan forekomme. Kort fortalt åpner NF for presis genuttrykkskontroll av en undertrykker som reduserer sitt eget uttrykk tilstrekkelig raskt, og begrenser dermed enhver endring bort fra en jevn tilstand. Steady state kan endres av en induser som inaktiverer eller eliminerer undertrykkeren for å muliggjøre mer proteinproduksjon til en ny steady state er nådd for hver induserkonsentrasjon. Nylig ble det opprettet et konstruert NF optogenetisk system som kan produsere en bred dynamisk respons av genuttrykk, opprettholde lav støy og reagere på lysstimuli som tillater potensialet for romlig genuttrykkskontroll11. Disse verktøyene, kjent som lys-inducible tunere (LITers), ble inspirert av tidligere systemer som tillot genuttrykkskontroll i levende celler4,10,29,30 og ble stabilt integrert i menneskelige cellelinjer for å sikre langsiktig genuttrykkskontroll.

Her, ved hjelp av LITer som eksempel, er en protokoll skissert for å skape lysresponsive genkretser, indusere genuttrykk med et lysplateapparat (LPA, en optogenetisk induksjonsmaskinvare)31, og analysere responsen til de konstruerte, optogenetisk kontrollerbare cellelinjene til tilpassede lysstimuli. Denne protokollen lar brukerne bruke LITer-verktøyene for ethvert funksjonelt gen de ønsker å utforske. Det kan også tilpasses andre optogenetiske systemer med ulike kretsarkitekturer (f.eks. positiv tilbakemelding, negativ regulering, etc.) ved å integrere metodene og optogenetisk utstyr som er skissert nedenfor. I likhet med andre syntetiske biologiprotokoller kan videoopptakene og optogenetiske protokoller som er skissert her, brukes i encellede studier på forskjellige områder, inkludert, men ikke begrenset til, kreftbiologi, embryonal utvikling og vevsdifferensiering.

Protocol

1. Design av genkrets Velg genetiske komponenter som skal kombineres i en enkelt genkrets/plasmid (f.eks. motiver for pattedyr DNA-integrasjonssekvens, lysresponsive elementer33 eller funksjonelle gener34). Bruk programvare for genteknologi og/eller molekylær kloning, lagre DNA-sekvensene for senere bruk og referanse, kommenter hver sekvens og undersøk alle nødvendige funksjoner (f.eks. Utvikle…

Representative Results

Genkretsmontering og stabil cellelinjegenerering i denne artikkelen var basert på kommersielle, modifiserte HEK-293-celler som inneholder et transkripsjonelt aktivt, enkeltstabilt FRT-sted (figur 1). Genkretsene ble konstruert i vektorer som hadde FRT-anlegg i plasmidet, noe som muliggjør Flp-FRT-integrasjon i HEK-293-cellegenomet. Denne tilnærmingen er ikke begrenset til Flp-In-celler, da FRT-nettsteder kan legges til hvilken som helst cellelinje av interesse hvor som helst i genomet ved…

Discussion

Lesere av denne artikkelen kan få innsikt i trinnene som er avgjørende for å karakterisere optogenetiske genkretser (så vel som andre genuttrykkssystemer), inkludert 1) genkretsdesign, konstruksjon og validering; 2) celleteknikk for innføring av genkretser i stabile cellelinjer (f.eks. Flp-FRT-rekombinasjon); 3) induksjon av de konstruerte cellene med en lysbasert plattform som LPA; 4) innledende karakterisering av lysinduksjonsanalyser via fluorescensmikroskopi; og 5) endelig genuttrykkskarakterisering med en rekke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil takke Balázsi lab for kommentarer og forslag, Dr. Karl P. Gerhardt og Dr. Jeffrey J. Tabor for å hjelpe oss med å konstruere den første LPA, og Dr. Wilfried Weber for å dele LOV2-degron plasmider. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R35 GM122561 og T32 GM008444]; Laufersenteret for fysisk og kvantitativ biologi; og et NDSEG-stipend (National Defense Science and Engineering Graduate). Støtte til åpen tilgang: NIH [R35 GM122561].

Forfatterbidrag: M.T.G. og G.B. unnfanget prosjektet. M.T.G., D.C. og L.G., utførte eksperimentene. M.T.G., D.C., L.G., og G.B. analyserte dataene og utarbeidet manuskriptet. G.B. og M.T.G. ledet prosjektet.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822 (2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247 (2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670 (2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18 (2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131 (2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521 (2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547 (2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314 (2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111 (2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363 (2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887 (2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128 (2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591 (2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. . PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. . The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849 (2017).
  48. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  49. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  50. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  51. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  52. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436 (2020).
  53. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  54. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , (2020).
  55. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766 (2019).
  56. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  57. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726 (2020).
  58. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  59. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  60. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355 (2020).

Tags

OptogeneticsGene CircuitsMammalian CellsSpatial-temporal ControlCell EngineeringGene ExpressionCloningTransfectionSingle-cell SortingMonoclonal CellsLPA Circuit3D Printed PartsIris SoftwareLight Stimulation
check_url/62109?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image