이 논문은 살아있는 환자 관련 전임상 모델 시스템에서 종양 약물 반응을 평가하기 위한 환자 유래 각종의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
약물 내성의 이해와 고저항성 암을 민감하게 하기 위한 새로운 전략의 개발은 환자 반응을 정확하게 예측할 수 있는 적합한 전임상 모델의 가용성에 의존합니다. 기존 전임상 모델의 단점 중 하나는 인간 종양 미세환경(TME)을 문맥적으로 보존하고 종양 내 이질성을 정확하게 나타내지 못해 데이터의 임상번역을 제한하는 것이다. 대조적으로, 인간 종양의 살아있는 단편의 문화를 대표함으로써, 환자 유래 한 절제 (PDE) 플랫폼은 원래 종양의 병리학 적 및 건축 적 특징을 가능한 한 가깝게 반영하는 3차원 (3D) 맥락에서 약물 반응을 검사 할 수 있게합니다. PDEs를 가진 이전 보고는 화학 저항하는 종양에서 화학반응을 구별하는 플랫폼의 기능을 문서화하고, 이 분리는 동일 화학요법에 참을성 있는 반응의 예측이다는 것을 보여주었습니다. 동시에, PDEs는 약물 반응을 예측하는 종양의 분자, 유전 적 및 조직학적 특징을 심문할 수 있게 하여 환자 계층화에 대한 바이오마커와 내성 종양에 민감하게 반응하는 새로운 중재 적 접근법을 식별할 수 있습니다. 이 논문은 환자 샘플 수집부터 끝점 분석에 이르기까지 PDE 방법론을 자세히 보고합니다. 그것은 특정 종양에 대한 맞춤형 조건을 강조, 절제 파생 및 배양 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다, 적절한 경우. 엔드포인트 분석을 위해, 종양 및 기질 영역 내의 주요 바이오마커의 공간 프로파일링을 위한 멀티플렉스 면역 형광 및 다중 스펙트럼 이미징에 초점이 있다. 이러한 방법을 결합함으로써, 다양한 임상 병리학 파라미터와 관련될 수 있는 정량적 및 질적 약물 반응 데이터를 생성하여 잠재적으로 바이오마커 식별에 사용될 수 있다.
서론
효과적이고 안전한 항암제의 개발은 예측 및 약동적 바이오마커의 식별을 용이하게 할 수 있는 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 적절한 전임상 모델이 필요합니다. 종양 간 이질성1,2,3,4,5 및 TME6,7,8,9,10,11,12는 항암제 반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 세포주, 오르가노이드 및 마우스 모델과 같은 많은 기존 전임상 암 모델은 이러한 결정적인 것을 완전히 수용할 수 없다. 기능. "이상적인" 모델은 종양 내의 비악성 세포와 악성종양의 복잡한 공간 상호 ....
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프로토콜
1. 조직 수집
- 수술 후, 신선한 배양 배지의 25mL를 포함하는 튜브로 새로 절제된 인간 종양 표본을 옮기고 (덜벡코의 수정된 독수리 배지는 4.5 g/L 포도당및 L-글루타민 + 1% (v/v) 태아 종아리 혈청 + 1% 페니실린-연쇄 절제술)으로 보충하였다. 멸균 클래스 II 후드에서 수술의 2 시간 이내에 식을 처리합니다.
2. Explant 준비
- 모든 수술 장비(접목 블레이드/치과 왁스 표면/핀셋)를 70% 산업용 메틸화 정신(IMS) 솔루션으로 청소하십시오.
- 10cm 문화 접시(재료 의 표참조)를 신선한 매체의 ~ 25 mL로 채우고 얼음 침대 위에 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여 시편을 치과 왁스 표면에 옮기고(재료 표참조) 두 개의 피부 이식 블레이드를 사용하여 조직을 약 2-3mm3mm의 조각으로 자른다.
참고 : 최상의 성능을 위해, 두께의 2-3mm의 개별 스트립을 얻기 위해 조직을 슬라이스 시작, 다음 최종 각을 얻기 위해 길이를 따라 스트립을 잘라. 전체 표본이 잘려야 ....
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결과
mIF 염색 조직학적 섹션의 다중 스펙트럼 이미징은 개별 세포 집단의 식별 및 phenotyping을 허용하고 각성 TME에서 종양 및 기질 성분의식별(도 2). 다중 스펙트럼 이미징은 높은 내재성 자동 불발력을 가진 조직의 분석에 특히 유용하며, 이는 자동 불피 신호가 다른 신호로부터 감속되고 후속 분석에서 제외될 수 있기 때문에 높은 콜라겐 함량을 가진 조직과 같은 조직분석에 특히 유용합니다. 실리코 조직 및 세포 세분화에 따라 원시 세포 수(예를 들어, 백분율 양성), 신호 강도, 세포 크기, 조직 영역 및 개별 세포의 공간 위치를 포함하되 이에 국한되지 않는 다수의 출력을 가진 약물 반응의 정량화를 허용한다.
조직 및 세포 세분화는 따라서 약물 치료 결과의 정량적 분석 및 종양 및 기질 별 반응의 식별에 매우 유용합니다. 예를 들어, 종양 마커와 함께 Ki67 및 cPARP에 대한 염색은 각각, 절제(그림
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토론
이 논문은 PdEs의 생성, 약물 치료 및 분석을 위한 방법을 설명하고 전임상 모델 시스템으로 플랫폼의 장점을 강조합니다. 그 분해를 포함하지 않는 갓 절제된 종양의 전 생체 배양은 종양아키텍처(13,24)의 보존을 허용하므로 TME의 세포 성분의 공간 상호 작용뿐만 아니라 종양 내 이질성. 이 방법은 종양 특이적 마커를 사용하여, 스트로마 영역대 종양 조직의 영역을 식별하고 따라서 이들 구획 내의 약물 반응을 분리하는 방법을 보여준다(도 3). 또한, 다중 바이오마커는 동시에 프로파일을 프로파일화하여 TME 내의 면역 세포의 표적이동(도 4)을평가할 수 있다.
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공개 사항
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감사의 글
우리는 외과 절제 된 종양 조직을 제공 에 대한 레스터 NHS 트러스트의 대학 병원에서 외과 의사와 병리학자 감사합니다. 우리는 또한 VEctra 폴라리스의 사용과 지원을 위해 FFPE 조직 블록과 키스 스트라트만의 조직 처리 및 단면에 도움을 핵심 생명 공학 서비스 내의 조직학 시설에 감사드립니다. 이 연구는 레스터 대학, MRC 독성학 단위, 암 연구 영국 치료 발견 실험실 및 LifeArc: 4개의 파트너로 구성된 Explant 컨소시엄에 의해 지원되고 투자되었습니다. 추가 지원은 CRUK-NIHR 레스터 실험암 의학 센터에 의해 제공되었습니다 (C10604/A25151). GM에 대 한 자금, CD, 그리고 NA 유방암 지금의 촉매 프로그램에 의해 제공 되었다 (2017NOVPCC1066), 화이자에서 자금에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Acetic acid | Sigma | 320099 | 염색 시약 |
| 항체 희석제/블록, 1x | Perkin Elmer | ARD1001EA | 항체 희석제/차단 버퍼 |
| Barnstead NANOpure Diamond | Barnstead | Ultra Pure (UP) H2O machine | |
| 시트르산 일수화물 | Sigma-Aldrich | C7129 | 시트르산염 완충액< |
| 강력한>Costar 다중 웰 세포 배양 플레이트용 시약 | Corning Incorporated | 3516 | 6 멀티웰 플레이트 |
| <>강력한DAPI 딜락테이트 | Life Technologies | D3571 | |
| 100 x 17 mm 접시, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | 조직 배양용 100 mm 직경 접시 |
| DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Sodium Pyruvate | Gibco (Life Technologies) | 10569-010 | 조직 배양 배지 (500 mL) |
| DPX mountant | VWR | 360294H | Mounting medium |
| DPX mountant | Merck | 6522 | 마운팅 배지 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | TE buffer용 시약 |
| Eosin | CellPath | RBC-0100-00A | 염색 시약 |
| Foetal Bovine Serum | Gibco | 10500-064 | 조직 배양에 사용 매체 |
| <강>37% 포름알데히드 | 피셔(아크로스) | 119690010 | 10% 포르말 |
| 린<강>iGenix, 전자레인지 IG2095 | iGenix | IG2095 | 항원 회수 |
| <강한>산업용 메틸화 증류주(IMS) | Genta Medical | 199050 | 99% 산업용 변성 알코올(IDA) |
| 에 사용InForm 고급 이미지 분석 소프트웨어 | Akoya Biosciences | InForm | |
| Leica ASP3000 Tissue Processor | Leica Biosystems | Automated Vacuum Tissue Processor | |
| Leica Arcadia H and C | Leica Biosystems | Embedding wax bath | |
| Leica RM2125RT | 라이카 바이오시스템 | 즈 로터리 마이크로톰 | |
| <스트롱>라이카 ST4040 선형 염색기 | 라이카 바이오시스템즈 | H& E 염색제 | |
| Mayer의 Haematoxylin | Sigma | GHS132-1L | 염색 시약 |
| Millicell Cell Cell Culture Inserts, 30 mm, 친수성 PTFE, 0.4 µ m | Merck Milipore | PICMORG50 | 유기형 배양 인서트 디스크 |
| Novolink 폴리머 검출 시스템 | Leica Biosystems | RE7150-K | DAB 염색 키트 |
| OPAL 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | Fluorophore with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 희석 |
| 제OPAL 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 디메틸설폭사이드(DMSO) 희석제 |
| <강력한>OPAL 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 디메틸설폭사이드(DMSO) 희석제 |
| <강력한>OPAL 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 디메틸설폭사이드(DMSO) 희석제 |
| OPAL 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 디메틸 설폭사이드(DMSO) 희석 |
| 제<강력한>OPAL 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 디메틸 설폭사이드(DMSO) 희석제 |
| OPAL 780 / OPAL TSA-DIG 시약 | Akoya Biosciences | FP1501001KT | 디메틸 설폭사이드(DMSO) 희석제 및 TSA-DIG 시약이 포함된 형광단 |
| Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x | Perkin Elmer | ARH1001EA | HRP polymer |
| Penicillin/streptomycin solution | Fisher Scientific | 11548876 | 조직 배양 매체 |
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| Phosphate Buffered Saline Tablets | Thermo Scientific Oxoid | BR0014G | PBS |
| 1x Plus Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore Diluent |
| Prolong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36961 | Mounting medium |
| Slide Carrier | Perkin Elmer | Vectra Polaris | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S/3160/63 | 10% 포르말 |
| 린Sodium Hydroxide 펠릿 | Fisher Scientific | S/4920/53 | 시트레이트 버퍼용 시약 |
| Tenatex 강화 왁스 - 핑크 (500 g) | KEMDENT | 1-601 | 치과 왁스 표면 |
| Thermo Scientific 면역염색 센터용 Shandon Sequenza 슬라이드 랙 | Fisher Scientific | 슬라이드 및 슬라이드 클립용 | 10098889 |
| Thermo Scientific Shandon 플라스틱 커버 플레이트 | Fisher Scientific | 11927774 | 슬라이드 클립 |
| Tris(하이드록시메틸)aminomethane(Tris) | Sigma-Aldrich | 252859 | TE 완충액용 시약 |
| VectaShield | Vecta Laboratories | H-1000-10 | 마운팅 매체 |
| Vectra Polaris Slide Scanner | Perkin Elmer | Vectra Polaris | Slide scanner |
| Xylene | Genta Medical | XYL050 | 디왁싱제 |
참고문헌
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. The New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).
- Jamal-Hanjani, M., et al. Tracking the evolution o....
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