यहां, हम चूहों में घाव के संक्रमण से बैक्टीरियल फैलाव का आकलन करने के लिए पूर्व वीवो और वीवो विधियों का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग सामयिक रोगाणुरोधी और एंटी-बायोफिल्म उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने या विभिन्न जीवाणु उपभेदों या प्रजातियों की फैलाव क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
बायोफिल्म से संबंधित संक्रमण पुरानी स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसाया जाता है जैसे गैर-उपचार मधुमेह पैर अल्सर, पुरानी साइनसाइटिस, ओटिटिस मीडिया को फिर से शुरू करना, और कई और अधिक। इन संक्रमणों के भीतर माइक्रोबियल कोशिकाओं को एक बाहकालीन बहुलक पदार्थ (ईपीएस) द्वारा संरक्षित किया जाता है, जो एंटीबायोटिक दवाओं को रोक सकता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संक्रमण को साफ करने से रोक सकता है। इस बाधा को दूर करने के लिए, जांचकर्ताओं ने संभावित चिकित्सा विज्ञान के रूप में फैलाव एजेंटों का विकास शुरू कर दिया है । ये एजेंट बायोफिल्म ईपीएस के भीतर विभिन्न घटकों को लक्षित करते हैं, संरचना को कमजोर करते हैं, और बैक्टीरिया के फैलाव की शुरुआत करते हैं, जो सैद्धांतिक रूप से एंटीबायोटिक शक्ति और प्रतिरक्षा निकासी में सुधार कर सकते हैं। घाव संक्रमण के लिए फैलाव एजेंटों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, हमने प्रोटोकॉल विकसित किए हैं जो बायोफिल्म फैलाव को पूर्व वीवो और वीवोदोनों में मापते हैं। हम एक माउस सर्जिकल एक्सिसेशन मॉडल का उपयोग करते हैं जिसे बायोफिल्म से जुड़े पुराने घाव संक्रमण बनाने के लिए अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। वीवो मेंफैलाव की निगरानी के लिए, हम घावों को बैक्टीरियल उपभेदों से संक्रमित करते हैं जो लूसिफ़ेरेस व्यक्त करते हैं। एक बार परिपक्व संक्रमण स्थापित हो जाने के बाद, हम एंजाइमों वाले समाधान के साथ घावों की सिंचाई करते हैं जो बायोफिल्म ईपीएस के घटकों को नीचा दिखाते हैं। फिर हम प्राप्त फैलाव के स्तर के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए घाव और छानने वाले अंगों में ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के स्थान और तीव्रता की निगरानी करते हैं। बायोफिल्म फैलाव के पूर्व वीवो विश्लेषण के लिए, संक्रमित घाव ऊतक बायोफिल्म-अपमानजनक एंजाइम समाधान में डूबे हुए हैं, जिसके बाद ऊतक में शेष बैक्टीरियल लोड, बनाम समाधान में बैक्टीरियल लोड का आकलन किया जाता है। दोनों प्रोटोकॉल में ताकत और कमजोरियां हैं और फैलाव उपचार की प्रभावकारिता को सही ढंग से निर्धारित करने में मदद करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
दुनिया भर में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के बढ़ने से विभिन्न प्रकार के जीवाणु संक्रमणों के इलाज के लिए एंटीबायोटिक विकल्पों की कमी हो रही है1. एंटीबायोटिक प्रतिरोध के अलावा, बैक्टीरिया बायोफिल्म से जुड़ी जीवनशैली2को अपनाकर एंटीबायोटिक सहिष्णुता हासिल कर सकते हैं । एक बायोफिल्म सूक्ष्मजीवों का एक समुदाय है जो पॉलीसैकराइड्स, एक्सपेरिअल डीएनए, लिपिड और प्रोटीन 3 के मैट्रिक्स द्वारा संरक्षित होता है, जिसे सामूहिक रूप से बाह्राश पॉलीमेरिक पदार्थ (ईपीएस) कहाजाताहै। एंटीबायोटिक प्रतिरोध संकट के रूप में जारी है, नई रणनीतियों है कि के उपयोग को लम्बा, या की प्रभावकारिता शक्तिशाली, एंटीबायोटिक दवाओं कष्टदाई रूप से की जरूरत है । एंटी-बायोफिल्म एजेंट एक आशाजनक समाधान4हैं।
प्रस्तावित विभिन्न एंटी-बायोफिल्म रणनीतियों में, फैलाव एजेंटों का उपयोग, जो बायोफिल्म ईपीएस के विभिन्न घटकों को लक्षित करते हैं, चिकित्सीय विकास5में सबसे आगे हैं। ग्लाइकोसाइड हाइड्रोलीज (जीएच) फैलाव एजेंट का एक ऐसा वर्ग है। GH एंजाइमों का एक बड़ा वर्ग है जो पॉलीसैकराइड्स के भीतर विभिन्न बांडों के दरार को उत्प्रेरित करता है जो ईपीएस को संरचनात्मक अखंडता प्रदान करते हैं। हमारे समूह के साथ-साथ अन्य लोगों ने दिखाया है कि जीएच बायोफिल्म्स को प्रभावी ढंग से नीचा दिखा सकता है, विट्रो और वीवो6,7,8,9,11दोनों में विभिन्न जीवाणु प्रजातियों के लिए फैलाव को प्रेरित कर सकता है और एंटीबायोटिक प्रभावकारिता में सुधार करसकताहै।
बायोफिल्म फैलाव में बढ़ती रुचि के साथ, प्रभावी तरीकों को विकसित करना महत्वपूर्ण है जो फैलाव प्रभावकारिता का आकलन करते हैं। यहां, हम चूहों में एक फैलाव एजेंट के साथ बायोफिल्म से जुड़े घाव संक्रमणों के उपचार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, और वीवो और पूर्व वीवोमें फैलाव प्रभावकारिता का आकलन करते हैं। समग्र लक्ष्य प्रभावी तरीकों को प्रदान करना है जिसका उपयोग बायोफिल्म फैलाव को प्रभावी ढंग से और कुशलता से मापने के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल के साथ किया जा सकता है।
इन अध्ययनों में बायोफिल्म से जुड़े संक्रमण को स्थापित करने के लिए एक मुरीन सर्जिकल एक्सीशन इंफेक्शन मॉडल का इस्तेमाल किया गया था। हमने 15 वर्षों से अधिक समय तक इस मॉडल का उपयोग किया है और अपनी टिप्पणियों को 7 ,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21में प्रकाशित किया है । सामान्य तौर पर, यह एक गैर-घातक संक्रमण मॉडल है जहां बैक्टीरिया घाव बिस्तर पर स्थानीयकृत रहते हैं और बायोफिल्म से जुड़े होते हैं (ईपीएस से घिरे समुच्चय में देखे जाने वाले बैक्टीरिया), एक पुराने संक्रमण की स्थापना करते हैं जो 3 सप्ताह तक रहता है। हालांकि, अगर चूहों को इम्यूनोसमझौता किया जाता है (उदाहरण के लिए टाइप 1 मधुमेह के साथ), तो वे इस मॉडल में घातक प्रणालीगत संक्रमण विकसित करने के लिए अधिक संवेदनशील हो सकते हैं।
इस रिपोर्ट में, हम वीवो और पूर्व वीवोदोनों में घाव से बैक्टीरिया के फैलाव का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। दोनों प्रोटोकॉल का उपयोग एक फैलाव एजेंट की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए किया जा सकता है और इसकी अपनी ताकत और कमजोरियां हैं। उदाहरण के लिए, वीवो में फैलाव का आकलन करने से फैलाव के बाद शरीर के अन्य हिस्सों में बैक्टीरिया के प्रसार के बारे में महत्वपूर्ण, वास्तविक समय की जानकारी प्रदान की जा सकती है, और मेजबान कैसे प्रतिक्रिया करता है। दूसरी ओर, फैलाव पूर्व वीवो का आकलन कई एजेंटों, खुराक, या योगों की स्क्रीनिंग के लिए अधिक वांछनीय हो सकता है, क्योंकि ऊतक को कई वर्गों में विभाजित किया जा सकता है जिन्हें अलग से परीक्षण किया जा सकता है, इस प्रकार आवश्यक चूहों की संख्या को कम किया जा सकता है। कई एजेंटों का आकलन करते समय, हम आम तौर पर विट्रो में पहले फैलाव को मापते हैं जैसा कि पहले 6,9,22वर्णित था। फिर हम बहुत आशाजनक एजेंटों की सीमित संख्या के लिए वीवो परीक्षण में सबसे प्रभावी पूर्व वीवो और रिजर्व का परीक्षण करते हैं।
यहां हम उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग बायोफिल्म फैलाव एजेंटों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न प्रकार के फैलाव एजेंटों, जीवाणु प्रज?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21 AI137462-01A1), टेड नैश लांग लाइफ फाउंडेशन, जैपर एल और जैक डेंटन विल्सन फाउंडेशन और रक्षा विभाग (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।
1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 14823434 | Use to complete serial dilutions of samples |
25G 58 in needle | Fisher | 14823434 | Attaches to 1 mL syringe |
Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture |
Amylase | MP Biomedicals | 2100447 | Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used |
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) | ZooPharm | RX216118 | Use as pain mainagement- may use other options |
Cellulase | MP Biomedicals | 2150583 | Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used |
Depilatory cream | Walmart | 287746 | Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair |
Dressing Forceps, Serrated Tips | Fisher | 12-460-536 | Can use other forms of forceps |
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL | Fisher | 101406 | Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria |
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer | MP Biomedicals | 6VFV9 | Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse |
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) | Fisher | 15340151 | Used to homogenize samples for plating |
Isoflurane | Diamond Back Drugs | ||
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN | Sigma Aldrich | K4138 | Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia |
LB broth, Miller | Fisher | BP1426-2 | Add 25 g/L and autoclave |
Lidocaine 2% Injectable | Diamond Back Drugs | 2468 | Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting |
Meropenem | Sigma Aldrich | PHR1772-500MG | Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment |
Non-sterile cotton gauze sponges | Fisher | 13-761-52 | Use to remove the depilatory cream |
PAO1 pQF50-lux bacterial strain | Ref [13] | N/A | PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results |
Petri dishes | Fisher | PHR1772-500MG | |
Phosphate Buffer Saline 10x | Fisher | BP3991 | Dilute 10x to 1x prior to use |
Polyurethane dressing | Mckesson | 66024007 | Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections |
Pseudomonas isolation agar | VWR | 90004-394 | Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes |
Refresh P.M. | Walmart | Use on eyes to reduce dryness during procedure. | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher | 22-363-750 | Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area |
Straight Delicate Scissors | Fisher | 89515 | Can also use curved scissors |
Swiss Webster mice | Charles River | 551NCISWWEB | Other mice strains can be used |
Syring Slip Tip 1 mL | Fisher | 14823434 | Used to administer drugs and enzyme treatment |