Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Summary

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Abstract

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

Introduction

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas¹. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a la^{biopelícula 2}. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas^3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a los antibióticos, se necesitan urgentemente nuevas estrategias que prolonguen el uso de antibióticos o potencien su eficacia. Los agentes anti-biopelículas son una solución prometedora⁴.

Entre las diferentes estrategias anti-biopelículas que se han propuesto, la utilización de agentes de dispersión, que se dirigen a diferentes componentes de la EPS de la biopelícula, están a la vanguardia del desarrollo terapéutico^5. Las hidrolasas de glucósido (GH) son una de esas clases de agente de dispersión. Gh son una gran clase de enzimas que catalizan la escisión de diferentes enlaces dentro de los polisacáridos que proporcionan integridad estructural a la EPS. Nuestro grupo, así como otros, han demostrado que la GH puede degradar eficazmente las biopelículas, inducir la dispersión y mejorar la eficacia de los antibióticos para una serie de especies bacterianas diferentes, tanto in vitro como in vivo^{6,7,8,9,10,11.}

Con un creciente interés en la dispersión de biopelículas, es importante desarrollar métodos efectivos que evalúen la eficacia de la dispersión. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el tratamiento de las infecciones de heridas asociadas a biopelículas con un agente de dispersión en ratones, y la evaluación de la eficacia de la dispersión, in vivo y ex vivo. El objetivo general es proporcionar métodos efectivos que se puedan utilizar con modelos preclínicos para medir la dispersión de biopelículas de manera efectiva y eficiente.

Un modelo quirúrgico murine de la infección de la supresión fue utilizado en estos estudios para establecer una infección biofilm-asociada. Hemos utilizado este modelo durante más de 15 años y publicado nuestras observaciones ampliamente^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21.} En general, este es un modelo de infección no letal donde las bacterias permanecen localizadas en el lecho de la herida y están asociadas al biofilm (bacterias que se ven en agregados rodeados de EPS), estableciendo una infección crónica que dura hasta 3 semanas. Sin embargo, si los ratones están inmunodeprimidos (con diabetes tipo 1, por ejemplo), pueden volverse más susceptibles a desarrollar una infección sistémica fatal en este modelo.

En este informe, proporcionamos protocolos para evaluar la dispersión de bacterias de una herida, tanto in vivo como ex vivo. Ambos protocolos se pueden utilizar para examinar la eficacia de un agente de dispersión y tienen sus propias fortalezas y debilidades. Por ejemplo, evaluar la dispersión in vivo puede proporcionar información importante en tiempo real sobre la propagación de bacterias a otras partes del cuerpo después de la dispersión, y cómo responde el huésped. Por otro lado, evaluar la dispersión ex vivo puede ser más deseable para la detección de múltiples agentes, dosis o formulaciones, ya que el tejido se puede dividir en múltiples secciones que se pueden probar por separado, reduciendo así el número de ratones requeridos. Al evaluar múltiples agentes, normalmente medimos la dispersión primero in vitro como se describió anteriormente ^6,9,22. Luego probamos el más efectivo ex vivo y reservamos la prueba in vivo para un número limitado de agentes muy prometedores.

Protocol

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. 1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón NOTA: Aquí describimos la infección de…

Representative Results

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con10 4 UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento. <s…

Discussion

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacteri…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment