Summary

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

Published: January 30, 2021
doi:

Summary

ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。

Abstract

上皮調節不全は、慢性創傷、炎症、およびすべてのヒト癌の80%以上を含む様々なヒトの状態および病気のためのノードである。ライニング組織として、皮膚上皮はしばしば損傷を受け、損傷した組織を修復するために必要な細胞可塑性を獲得することによって進化的に適応している。長年にわたり、in vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルを用いて上皮可塑性を研究するためにいくつかの努力がなされてきた。しかし、これらの取り組みは、上皮細胞可塑性の様々な段階を再現する能力が限られている。ここでは、原発性新生児ヒトケラチノサイトから3D表皮スフェロイドおよび表皮スフェロイド由来細胞を生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、ケラチノサイト生成可塑性の異なる段階を機能的にモデル化する表皮スフェロイド培養の能力を概説し、表皮スフェロイド再めっきが、integrinα6hi/EGFRlo ケラチノサイト亜集団の不均種正常ヒトケラチノサイト(NHKc)培養を増強できることを示している。我々の報告書は、皮膚角化細胞の可塑性および表皮再生の研究のための高スループットシステムの開発および維持について述べている。

Introduction

哺乳類の階層化上皮は、すべての生活システムにおいて最も複雑な上皮アーキテクチャであり、ほとんどの場合、損傷および損傷を受ける。保護組織として、階層化上皮は複雑で効果的な組織損傷応答を生成するように進化した。損傷を受けた細胞は、系統可塑性プログラムを有効にする必要があり、これを使用して損傷した部位に移行し、修復1、2、3を実行できるようにする必要があります。この多面的な応答は、よく理解されていないいくつかの連続したステップで発生します。

上皮再生の複雑なプロセスを研究する上の主要な障害は、細胞再生の定義された段階で動的な細胞活動をキャプチャすることができる高スループットモデルシステムの枯渇にあります。in vivoマウスモデルは創傷治癒に関する関連する洞察を提供し、人間の再生プロセスを最も密接に再現しますが、その開発には手間のかかる労力と大幅なコストが必要であり、スループット能力が制限されます。したがって、高スループットスケールでヒト上皮組織再生の機能調査を可能にするシステムを確立する上で重要なニーズが存在する。

近年、スケーラビリティの課題に対応するために、いくつかの試みが行われています。これは、インビボ再生コンテキストを密接に模倣する革新的なin vitroおよびex vivo細胞ベースのモデルの大きな拡大を通じて見られます。これには、オルガンオンチップ4、スフェロイド5、オルガノイド6、オルガノイド文化7の進歩が含まれます。これらの3D細胞ベースのシステムは、それぞれ独自の利点を提供し、独特の実験的限界を提示します。現在までに、スフェロイド培養は、最も費用対効果が高く、広く使用されている3D細胞培養モデルです。また、いくつかの報告では、スフェロイド培養物を皮膚幹細胞の特性を研究するために使用できることが示されているが、これらの研究は主に動物組織8、9、または皮膚線維芽細胞10で行われ、ヒト表皮スフェロイド培養物の再生特性を徹底的に特徴付ける報告はほとんどない。本プロトコルでは、通常ヒトケラチノサイト(NHKc)由来の表皮スフェロイド培養物の機能開発、培養、維持について詳述する。我々は、このシステムの有用性を同様に、表皮再生およびケラチノサイト幹細胞可塑性の逐次相を試験的にモデル化する。

Protocol

皮膚標本の採取と取り扱い、ヒトケラチノサイトの分離に関するプロトコルは、サウスカロライナ大学(UofSC)IRBによってレビューされ、「ヒト被験者を含まない研究」に分類され、包皮標本は定期的な外科的処置(新生児の男の子の割礼)の間に作製された外科的廃棄であり、識別情報を完全に欠いていた。この議定書は、UofSCバイオセーフティ委員会によって定期的に審査および承認され、す?…

Representative Results

皮膚表皮球アッセイの間、NHKc培養物は96ウェルプレートのアガロースコーティングされたウェルに播種される(図1A)。球状形成細胞は48時間以内に自己凝集するべきである。自律回転楕円体形成は、標準の反転位相コントラスト顕微鏡を用いて、早くも24時間評価することができる。表皮組織形成および再めっきアッセイは、表皮組織再生の様々な相をモデル化する(<strong…

Discussion

3Dスフェロイド培養システムの使用は、細胞幹細胞性を評価する上で幅広い有用性を有している。これらのシステムは、組織幹細胞13の濃縮を増強することが実証されているが、ヒト表皮幹細胞の研究に有用性は限られたものであった。ここでは、3D培養技術を用いてヒトケラチノサイト幹細胞を濃縮する戦略について述べています。このシステムでは、NHKcは、KSFM-scmを含む?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

UofSC医学部計装資源施設(IRF)は、イメージングおよび細胞選別装置へのアクセスと技術支援を提供しました。この作業は、グラント 1R21CA201853 によって部分的にサポートされました。MCF および IRF は、NIH グラント P20GM103499 SC INBRE から部分的なサポートを受けます。MCF は、NIH グラント P20GM109091 からのサポートも受けています。イヴォン・ウォッピは、NIH助成金2R25GM066526-06A1(PREP)とR25GM076277(IMSD)、UofSCのグレース・ジョーダン・マクファデン教授プログラムによるフェローシップによって部分的にサポートされました。ジェラルディン・エゼカとジャスティン・ヴェルチェリーノは、UofSCでNIH助成金2R25GM066526-10A1(PREP)によってサポートされました。ショーン・M・ブロースは、UofSCで2016マゼラン学者賞を受賞しました。

Materials

Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

References

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Cite This Article
Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity. J. Vis. Exp. (167), e62182, doi:10.3791/62182 (2021).

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