多西环素加载胶原蛋白-奇托桑复合支架，用于加速治疗糖尿病伤口
Summary
准备好的 DOX-CL 脚手架满足了机械强度、孔隙度、吸水率、降解率、持续释放、抗菌、生物相容性和抗炎特性的理想 DW 敷料的先决条件，这些都被认为是 DW 中受损组织恢复的关键。
Abstract
糖尿病的一个主要并发症是糖尿病伤口（DW）。糖尿病炎症的延长阶段阻碍了导致伤口愈合延迟的进一步阶段。我们选择多西环素（DOX），作为一种潜在的药物的选择，因为它的抗菌性能，以及它报告的抗炎特性。目前的研究旨在制定DOX加载胶原蛋白-奇托桑非交联（NCL）和交联（CL）脚手架，并评估其在糖尿病条件下的愈合能力。脚手架的定性结果表明，与 DOX-NCL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有理想的孔隙性、低肿胀和降解率以及 DOX 的持续释放。 体外 研究表明，与处理和控制组的 CL 脚手架相比，DOX-CL 脚手架具有生物相容性和增强的细胞生长。抗菌研究表明，DOX-CL脚手架比CL脚手架对DW中最常见的细菌更有效。使用链球菌素和高脂肪饮食诱导的DW模型，观察到DIX-CL脚手架治疗组的伤口收缩速度明显（p≤0.05）。使用 DOX-CL 脚手架可以证明是治疗 DW 的有希望的方法。
Introduction
糖尿病（DM）是一种身体未能提供胰岛素或对直接糖的异常消化结果作出反应的情况，导致血糖 1的激增。DM 最连续和最破碎的纠缠是糖尿病伤口 （DW）。大约25%的DM患者有机会在有生之年建立 DW。DW 的阻碍愈合被认可为 DM 的三种病变：免疫病变、血管病和神经病变。每当DW得不到治疗，它可能导致坏死的发展，因此促使有关器官 2的删除。
大量的治疗方法，如指导病人（每天检查伤口，清洁伤口，避免对伤口造成压力的活动，定期葡萄糖监测等），控制他们的血糖，伤口脱脂，压力卸载，医疗程序，高压氧疗法，和先进的治疗是在实践3，4。鉴于多因素病理生理条件和与这些药物相关的意外费用，这些药物大多未能解决DW护理至关重要的所有先决条件。即使DW发病机制是多因素的，但组织管理不当的持续炎症是DW 5、6中延迟愈合的实际原因。
DW中炎症和亲炎症调解人的增加水平导致导致伤口愈合延迟的生长因子减少2，6。DW 中细胞外矩阵 （ECM） 的形成被认可为矩阵金属蛋白酶 （MMP） 水平增加，导致已形成的 ECM 的快速降解。在MMP中，MMP-9被报告为主要中间人，负责长期炎症和快速ECM降解7。据说，局部治疗与抗炎药物，降低MMP-9的升高水平，重新建立皮肤平衡，框架安排，并提示更好的愈合DWs8，9。
多西环素（DOX），一种MMP-9抑制剂，被选择来抑制MMP-9的升高水平，MMP-9是负责10、11、12号DWs持续炎症的主要炎症调解人。此外，DOX 拥有抗氧化剂（产生能够与活性氧物种结合的自由羟基和苯氧基）13和抗凋零（抑制卡斯帕塞表达和线粒体稳定）14项对治疗 DW 至关重要的活动。选择了包含 DOX、胶原蛋白 （COL） 和奇托桑 （CS） 的框架安排。COL的选择取决于它如何帮助提供必要的框架负责机械强度和组织再生15。另一方面，CS在结构上与糖糖糖素同源，与几个伤口愈合阶段相关。另据报道，CS持有显著的抗菌特性15。因此，DOX 的 COL/CS 脚手架被配制以抑制长期炎症，然后支持矩阵形成，以便在 DM 条件下成功愈合伤口。
Protocol
所有动物程序都得到了印度奥蒂JSS药学院动物伦理委员会的批准。 1. 通过冷冻干燥方法制备 DOX 装载多孔脚手架 将 1.2 克 COL 添加到 100 毫升水（例如米利波尔），并留出以防肿胀。 在 2000 rpm 时搅拌肿胀的 COL 分散，以确保 COL 完全解散。 通过溶解约 0.8 克 CS 在 100 mL 的 1% 醋酸中准备 CS 解决方案。 在 2000 rpm 时将 CS 解决方案搅拌过夜，以确保均?…
Representative Results
DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征在目视检查中，NCL 和 CL 脚手架被发现为彩色奶油色。此外，两个脚手架似乎都像海绵，僵硬和无弹性时，身体检查。NCL 和 CL 脚手架的 SEM 图像显示在 图 1中。从数字上看，通过形成分子间联系，在交叉链接后，孔径尺寸明显减少。此外，NCL和CL脚手架孔隙度分别为92.3±4.21和71.35±2.65。NCL和CL脚手架的吸水百分比为750±11.4%和492±8….
Discussion
本研究的主要目的是确定 DOX 装载的 COL-CS 脚手架对大鼠 DW 愈合的影响。CL 和 NCL 在形态、肿胀指数、体外释放动力学和生物相容性方面进行了准备和评估。
DOX 加载 NCL 和 CL 脚手架的特征
已准备好的脚手架被发现多孔，毛孔相互连接。这些相互关联的毛孔确保多孔、海绵状的性质，有助于将氧气和营养物质适当扩散到细胞中，从而促进增殖和迁移，从而加速愈…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢阿希什·瓦德瓦尼博士。（印度奥蒂JSS药学院药物生物技术系助理教授兼系主任）协助 体外 细胞生存能力研究。
作者要感谢新德里大学和高等教育机构科技基础设施改善基金（DST-FIST）支持我们系。
作者也想感谢三菊先生。S 和斯里拉姆先生纳鲁库拉M.制药学生的支持，在视频拍摄。
这项研究得到了JSS高等教育与研究学院（JSSAHER）的支持。
Materials
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
References
- . IDF Diabetes Atlas, 9th edn Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019)
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
- Alexiadou, K., Doupis, J. Management of diabetic foot ulcers. Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O’Toole, E. A. Metalloproteinases and wound healing. Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -. C., Chang, C. -. P., Lin, S. -. M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -. Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. Clinical Perspective. Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
Cite This Article
Sanapalli, B. K. R., Chinna Gounder, K., Ambhore, N. S., Kuppuswamy, G., Thaggikuppe Krishnamurthy, P., Karri, V. V. S. R. Doxycycline Loaded Collagen-Chitosan Composite Scaffold for the Accelerated Healing of Diabetic Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62184, doi:10.3791/62184 (2021).