포신 각막 조직 은 포진 심플렉스 바이러스-1 항 바이러스의 효능을 연구하기 위해 퇴치

Summary

우리는 실험 약물의 항 바이러스 효능을 테스트하기 위해 돼지 각막의 사용을 설명합니다.

Abstract

바이러스 및 박테리아는 각막 감염을 통해 상처 및 궤양과 같은 다양한 안구 표면 결함 및 변성을 일으킬 수 있습니다. 전 세계적으로 60-90%의 혈청률을 가지면 포진 심플렉스 바이러스 유형-1(HSV-1)은 일반적으로 병변 및 감염 관련 실명으로 나타나는 오로페이셜 영역의 점막 병변을 유발합니다. 현재 항 바이러스 약물은 효과적인 동안, 저항의 출현 및 독성 부작용의 지속이 유비쿼터스 병원체에 대 한 새로운 항 바이러스의 개발을 필요로. 체외 평가는 신흥 항 바이러스에 관한 몇 가지 기능적 데이터를 제공하지만 생체 내에서 안구 조직의 복잡성을 입증하지는 않습니다. 그러나 생체 내 연구는 비싸고 특히 바이러스 성 에이전트와 함께 작업 할 때 숙련 된 인력이 필요합니다. 따라서 ex vivo 모델은 항 바이러스 검사를위한 효율적이면서도 저렴한 단계입니다. 여기서 우리는 돼지 각막 전 생체를 사용하여 HSV-1에 의감염을 연구하는 프로토콜과 기존 및 새로운 항 바이러스 약물을 사용하여 국소적으로 치료하는 방법에 대해 논의합니다. 우리는 또한 HSV-1을 사용하여 플라크 분석법을 수행하는 방법을 시연한다. 상세한 방법은 HSV-1 병원체를 닮은 감염을 공부하기 위하여 유사한 실험을 수행하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Introduction

안구 감염으로 고통받는 사람들은 종종 시력 상실^1을발생시다. 전 세계적으로 높은 혈청병으로, HSV 감염된 개별은 각막 흉터, 기질 각질염 및 신생 혈관 화^2,3,4,5로이끌어 내는 되풀이눈 감염 때문에 손해를 입습니다. HSV 감염은 또한 덜 빈번하게 일으키는 원인이 되는 것을 보여주었습니다, 면역 손상중 심각한 조건의 범위, 뇌염 및 전신 이환 과 같은 치료되지 않는 환자^6,7,8. Acyclovir 같은 약물 (ACV) 그리고 그것의 뉴클레오시드 유사체는 HSV-1 감염을 억제하고 심지어 재활성화를 통제에 일관된 성공을 보여주었지만, 이러한 약물의 장기간 사용은 신장 실패, 태아 이상 및 진화 하는 바이러스 균주에 약물 저항의 출현을 제한 하는^{실패9,10,11,12,13.} HSV-1 안구 감염과 관련되었던 복잡성은, 이전에 인간 각막 세포의 단층 및 3D 배양을 사용하여 시험관내에서 연구되고 murine 또는 토끼 안구 감염을 사용하여 생체내에서 공부되었습니다. 이러한 체외 모델은 HSV-1 감염의 세포 생물학적 구성 요소에 대한 중요한 데이터를 제공하지만, 그러나 각막 조직의 복잡한 복잡성을 모방하지 못하고 바이러스^14의수지상 확산을 조명하는 데 거의 영향을 미치지 않는다. 대조적으로, 생체 내 시스템은 HSV-1 감염 도중 각막 및 면역 활성화 반응에 있는 감염 퍼짐을 보여주는에 있는 더 통찰력이 있더라도, 그(것)들은 실험을 간과하기 위하여 동물 배려를 위한 훈련된 조사자 및 큰 시설이 필요하다는 주의와 함께 옵니다.

여기서 우리는 HSV-1 감염 유도 상처 시스템을 검사하기 위해 전 생체 모델으로 돼지 각막을 사용합니다. 감염에 기인한 상처 시스템의 세포 및 분자 생물학뿐만 아니라 특정 약물의 잠재적 인 약리학은 조직 각성 배양을 통해 연구 될 수있다. 이 모형은 또한 그밖 바이러스성 및 세균성 감염을 위한 사용을 위해 개정될 수 있습니다. 이 연구에서는, 돼지 각막은 전임상 소분자, BX795의 항바이러스 효능을 시험하기 위해 사용되었다. 돼지 각막의 사용은 접근의 용이성과 비용 효과때문에 선호되었다. 또한, 돼지 각막 모델은 각막이 분리되기 쉽고 감염 및 시각화를 위한 적절한 크기이며^15를처리할 수 있는 견고한 것으로 인간의 눈의 좋은 모델입니다. 돼지 각막은 또한 트랜스 각막 투과성 및 전신 흡수¹⁵모두에서 인간 각막 모델의 복잡성과 유사하다. 연구를 위해 이 모델을 사용하여, 우리는 BX795가 HSV-1 바이러스 감염의 유능한 억제제로 추가 조사의 가치가 있는 방법을 설명할 수 있었고 잠재적인 소분자 항바이러스^{화합물(16)으로}분류하는 문헌에 추가하였다.

Protocol

이 연구에 사용된 모든 돼지 조직은 제 3 자 민간 조직에 의해 제공되었으며 시카고 직원의 일리노이 대학에 의해 동물 취급이 수행되지 않았습니다. 1. 재료 시약 플라크 분석시 다음 시약을 사용하십시오: 분말 메틸셀룰로오스, 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 및 연쇄 절제술(P/S)을 플라크 분석용으로 사용하십시오….

Representative Results

실험적인 항 바이러스의 효능을 이해하려면 생체 내 인체 임상 시험을 위해 전송되기 전에 광범위하게 테스트해야합니다. 이와 관련하여, 긍정적 인 제어, 부정적인 제어 및 테스트 그룹을 식별해야합니다. 트리플루오로티미딘(TFT)은 오랫동안 헤르페스 각막염을국소적으로치료하는 바람직한 치료법으로 사용되어 왔다. 양성 대조군으로 사용, TFT 처리 각막 그룹은 낮은 감염 확?…

Discussion

이전 연구는 BX795 HSV-1 감염에 대 한 항 바이러스 에이전트로 유망한 역할을 보여 주었다; TANK 결합 키나아제 1 (TBK1)^16을억제함으로써. TBK1과 자가식 모두 인간 각막 상피 세포에서 입증된 바와 같이 HSV-1 감염을 억제하는 데 중요한 역할을 했습니다. BX795는 10μM의 농도에서 항바이러스 활성을 최대한 효과적으로 효과적이높은 것으로 나타났으며, 주요 바이러스 성 단백질의 서양 블…

Materials

30 G hypodermic needles.	BD	305128
500 mL glass bottle.	Thomas Scientific	844027
Antimycotic and Antibiotic (AA)	GIBCO	15240096	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer.	BioDot	BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs.	Puritan	22029501
Cell scraper – 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
Crystal violet	Sigma Aldrich	C6158	Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM	GIBCO	41966029	Store at 4 °C until use
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023
Fetal bovine serum -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2.	Harward Instruments	72-8595
Freezers –80 °C. –	Thermofisher Scientific	13 100 790
Fresh box of blades.	Thomas Scientific	TE05091
Guaze	Johnson & Johnson		108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP	grown in house	–	Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium – ITS	GIBCO	41400045	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer.	Thomas Scientific	H3710-HS
Metallic Scissors.	Harward Instruments	72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL.	Thomas Scientific	1159M37
Minimum Essential Medium – MEM	GIBCO	11095080	Store at 4 °C until use
OptiMEM	GIBCO	31985047	Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin.	GIBCO	15140148	Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS	GIBCO	10010072	Store at room temperature
Porcine Corneas	Park Packaging Co., Chicago, IL	0	Special order by request
Procedure bench covers – as needed.	Thermofisher Scientific	S42400
Serological Pipettes	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment.	Thomas Scientific	Ezpette Pro
Stereoscope	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Stirring magnet.	Thomas Scientific	F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2.	Thomas Scientific	T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature.	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well).	Thomas Scientific	T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25-300-062	Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586