Summary

単純ヘルペスウイルス-1抗ウイルス薬の有効性を研究するブタ角膜組織外植

Published: September 20, 2021
doi:

Summary

実験薬の抗ウイルス効果を試験するためのブタ角膜の使用について述べる。

Abstract

ウイルスや細菌は、角膜感染を通じて様々な眼表面欠陥や創傷や潰瘍などの変性を引き起こす可能性があります。世界の60〜90%の範囲の血清過率で、単純ヘルペスウイルスタイプ1(HSV-1)は、一般的に病変および感染関連失明としても現れる口顔面領域の粘膜皮病変を引き起こす。現在の抗ウイルス薬は有効ですが、毒性副作用の耐性と持続性の出現は、このユビキタス病原体に対する新しい抗ウイルス薬の開発を必要とします。in vitro評価は、新たな抗ウイルスに関する機能的なデータを提供するが、生体内の眼組織の複雑さを示すものではありません。しかし、in vivo研究は高価であり、特にウイルス剤を扱う場合には訓練を受けた人員を必要とする。したがって、ex vivoモデルは、抗ウイルス検査のための効率的でありながら安価なステップです。ここでは、ブタコルネエクスビボを用いてHSV-1による感染を研究するプロトコルと、既存および新規の抗ウイルス薬を用いてそれらを局所的に治療する方法について議論する。また、HSV-1を用いてプラークアッセイを行う方法も実証する。詳細な方法は、HSV-1病原体に似た感染症を研究するために同様の実験を行うために使用することができる。

Introduction

眼感染症に罹患している人は、しばしば視力低下1を起こします。世界的に高い血清威容性を持つHSV感染者は、角膜瘢痕化、間質角膜炎および新血管新生症至る眼感染症の再発に苦しむ2、3、4、5。HSV感染はまた、より少ない頻度を引き起こすことが示されている、免疫不全の間で重篤な状態の範囲、脳炎および全身性罹患率6、7、8のような未治療の患者。アシクロビル(ACV)およびそのヌクレオシド類似体のような薬物は、HSV-1感染を抑制し、再活性化を制御することに一貫した成功を示していますが、これらの薬物の長期使用は腎不全、胎児の異常および進化するウイルス株9、10、11、12、13に対する薬剤耐性の出現を制限する失敗に関連している。HSV-1眼感染症に関連する複合体は、マウスまたはウサギの眼感染症を用いてヒト角膜細胞の単層および3D培養物および生体内でのインビトロで以前に研究されてきた。これらのin vitroモデルはHSV-1感染の細胞生物学的構成要素に関する重要なデータを提供するが、しかし、角膜組織の複雑な複雑さを模倣できず、ウイルス14の樹状拡散を照らすことはほとんどしない。対照的に、in vivoシステムは、HSV-1感染中に角膜および免疫活性化応答で感染が広がっていることを示す上でより洞察力があるが、実験を見落とすために訓練を受けた研究者と動物ケアのための大規模な施設が必要であるという警告が付属している。

ここでは、HSV-1感染誘発創傷系を調べるために、ブタ角膜をex vivoモデルとして使用します。特定の薬物の潜在的な薬理学だけでなく、感染によって引き起こされる創傷系の細胞および分子生物学の両方を組織外植物培養を通じて研究することができる。このモデルは、他のウイルスおよび細菌感染の使用についても修正される可能性があります。本研究では、ブタコーンネを用い、前臨床小分子BX795の抗ウイルス効果を試験した。ブタの角膜の使用は、アクセスの容易さと費用対効果のために好まれました。さらに、ブタ角膜モデルは、角膜が単離しやすく、感染および可視化のために十分な大きさで、15を処理するための堅牢な人間の目の良いモデルです。ブタ角膜はまた、トランス角膜透過性および全身吸収15の両方におけるヒト角膜モデルの複雑さに匹敵する。このモデルを用いて研究を行うことで、HsV-1ウイルス感染の有能な阻害剤としてBX795がさらなる調査に値する方法を解明し、それを潜在的な低分子抗ウイルス化合物16として分類する文献に加えた。

Protocol

この研究で使用されるすべてのブタ組織は、第三者の民間組織によって提供され、動物の取り扱いのいずれもイリノイ大学シカゴ校の職員によって行われませんでした。 1. 材料 試薬 プラークアッセイの試薬として、パウダーメチルセルロース、ダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシン(P/S)を使用…

Representative Results

実験的な抗ウイルス薬の有効性を理解するには、生体内ヒト臨床試験のために送られる前に、広範囲にテストする必要があります。この点に関して、正の対照、陰性対照および試験群を同定しなければならない。トリフルオロチミジン(TFT)は、長い間、角膜炎を局所的に治療するための好ましい治療法として使用されてきた。陽性対照として使用され、TFT処置された角膜基?…

Discussion

以前の研究は、HSV-1感染に対する抗ウイルス剤として有望な役割を有することを示しているBX795;タンク結合キナーゼ1(TBK1)16を阻害することによって。TBK1とオートファジーの両方がヒト角膜上皮細胞で実証されるようにHSV-1感染を阻害する役割を果たしてきました。BX795は、10μMの濃度で抗ウイルス活性と最大に有効であることが示され、主要ウイルスタンパク質のウェスタン?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、D.S.A.A.A.A.A.に対するNIH助成金(R01 EY024710、RO1 AI139768、RO1 EY029426)によって支えられ、NIH国立眼科研究所からのF30EY025981助成金によって支えられた。研究は、パークパッキング会社、4107アシュランドアベニュー、ニューシティ、シカゴ、IL-60609から得たブタの角膜を使用して行われました

Materials

30 G hypodermic needles. BD 305128
500 mL glass bottle. Thomas Scientific 844027
Antimycotic and Antibiotic (AA) GIBCO 15240096 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Benchtop vortexer. BioDot BDVM-3200
Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. Thermofisher Scientific Herasafe 2030i
Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. Puritan 22029501
Cell scraper – 25 cm Biologix BE 70-1180 70-1250
Crystal violet Sigma Aldrich C6158 Store the powder in a dark place
Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM GIBCO 41966029 Store at 4 °C until use
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Fetal bovine serum -FBS Sigma Aldrich F2442 Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use
Flat edged tweezers – 2. Harward Instruments 72-8595
Freezers –80 °C. – Thermofisher Scientific 13 100 790
Fresh box of blades. Thomas Scientific TE05091
Guaze Johnson & Johnson 108 square inch folder 12 ply
HSV-1 17GFP grown in house Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17
Insulin, Transferrin, Selenium – ITS GIBCO 41400045 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Magnetic stirrer. Thomas Scientific H3710-HS
Metallic Scissors. Harward Instruments 72-8400
Micropipettes 1 to 1000 µL. Thomas Scientific 1159M37
Minimum Essential Medium – MEM GIBCO 11095080 Store at 4 °C until use
OptiMEM  GIBCO 31985047 Store at 4 °C until use
Penicillin/streptomycin. GIBCO 15140148 Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use
Phosphate Buffer Saline -PBS GIBCO 10010072 Store at room temperature
Porcine Corneas Park Packaging Co., Chicago, IL 0 Special order by request
Procedure bench covers – as needed. Thermofisher Scientific S42400
Serological Pipettes Thomas Scientific P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serological Pipetting equipment. Thomas Scientific Ezpette Pro
Stereoscope Carl Zeiss SteREO Discovery V20
Stirring magnet. Thomas Scientific F37120
Tissue culture flasks, T175 cm2. Thomas Scientific T1275
Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. Thermofisher Scientific Forma 50145523
Tissue culture treated plates (6-well). Thomas Scientific T1006
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25-300-062 Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use
Vero cells American Type Culture Collection ATCC CRL-1586

References

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Cite This Article
Yadavalli, T., Volety, I., Shukla, D. Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals. J. Vis. Exp. (175), e62195, doi:10.3791/62195 (2021).

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