רקמת קרנית חזירית Explant ללמוד את היעילות של וירוס הרפס סימפלקס-1 אנטי ויראלי
Summary
אנו מתארים את השימוש בקרנית חזירית כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של תרופות ניסיוניות.
Abstract
וירוסים וחיידקים יכולים לגרום למגוון פגמים בקרצוף העין והתנוונות כגון פצעים וכיבים באמצעות זיהום בקרנית. עם seroprevalence הנע בין 60-90% ברחבי העולם, וירוס הרפס סימפלקס סוג-1 (HSV-1) בדרך כלל גורם נגעים ריר של האזור orofacial אשר באים לידי ביטוי גם כמו נגעים ועיוורון הקשורים לזיהום. בעוד התרופות האנטי ויראליות הנוכחיות יעילות, הופעת ההתנגדות וההתמדה של תופעות לוואי רעילות מחייבת פיתוח של תרופות אנטי ויראליות חדשניות נגד פתוגן זה בכל מקום. למרות בהערכת במבחנה מספק כמה נתונים פונקציונליים לגבי אנטי ויראלי המתעורר, הם אינם מדגימים את המורכבות של רקמת העין ב vivo. עם זאת, במחקרים vivo הם יקרים דורשים כוח אדם מאומן, במיוחד כאשר עובדים עם סוכנים ויראליים. לפיכך דגמי ex vivo הם צעדים יעילים אך זולים לבדיקות אנטי ויראליות. כאן אנו דנים בפרוטוקול לחקר זיהום על ידי HSV-1 באמצעות קרניות חזיר ex vivo ושיטה לטיפול בהם באופן מקומי באמצעות תרופות קיימות וחדשניות. אנו גם מדגימים את השיטה לביצוע ביצוע פלאק באמצעות HSV-1. השיטות המפורטות עשויות לשמש לעריכת ניסויים דומים לחקר זיהומים הדומים לפתוגן HSV-1.
Introduction
אנשים הסובלים מזיהומים בעיניים לעתים קרובות נגרמים אובדן ראייה1. עם seroprevalence גבוה ברחבי העולם, אנשים נגועים HSV סובלים דלקות עיניים חוזרות אשר מובילים הצטלקות קרנית, קרטיטיס סטרומה וניאווסקולריזציה2,3,4,5. זיהומים HSV הראו גם לגרום בתדירות נמוכה יותר, מגוון של מצבים חמורים בקרב immunocompromised, חולים לא מטופלים כמו דלקת המוח ותחלואה מערכתית6,7,8. תרופות כמו Acyclovir (ACV) ואנלוגי הנוקלאוזיד שלה הראו הצלחה עקבית בריסון זיהום HSV-1 ואפילו לשלוט בהפעלה מחדש, אך השימוש הממושך בתרופות אלה קשור לאי ספיקת כליות, חריגות עובריות ואי הגבלת הופעת עמידות לסמים לזנים ויראליים מתפתחים9,10,11,12,13. מורכבויות הקשורות לזיהומים עיניים HSV-1, נחקרו בעבר במבחנה באמצעות monolayers ו תרביות 3D של תאי הקרנית האנושיים in vivo באמצעות זיהומים מורין או עיני ארנב. בעוד מודלים במבחנה אלה מספקים נתונים משמעותיים על הרכיבים הביולוגיים התאיים של זיהומים HSV-1, הם, עם זאת, אינם מצליחים לחקות את המורכבות המורכבת של רקמת הקרנית ולא עושים הרבה כדי להאיר את ההתפשטות הדנדריטית של הנגיף14. לעומת זאת, למרות שבמערכות vivo תובנות יותר בהצגת התפשטות זיהום בקרנית ותגובות הפעלה חיסוניות במהלך זיהום HSV-1, הם מגיעים עם האזהרה כי הם דורשים חוקרים מיומנים ומתקנים גדולים לטיפול בבעלי חיים להתעלם מהניסויים.
כאן אנו משתמשים בקרנית חזירים כמודל ex vivo כדי לבחון את מערכת הפצע המושרה זיהום HSV-1. הן את הפרמקולוגיה הפוטנציאלית של תרופות מסוימות, כמו גם את התא ואת הביולוגיה המולקולרית של מערכת הפצע הנגרמת על ידי הזיהום ניתן ללמוד באמצעות תרביות explant רקמות. מודל זה עשוי להיות מתוקן גם לשימוש עבור זיהומים ויראליים וחיידקיים אחרים גם כן. במחקר זה, קרניות חזיר שימשו כדי לבדוק את היעילות האנטי ויראלית של מולקולה קטנה פרה-קלינית, BX795. השימוש בקרניות חזירים היה מועדף בשל קלות הגישה וחסכונות העלות. בנוסף, מודלים קרנית חזיר הם מודלים טובים של עיניים אנושיות עם קרניות להיות קל לבודד, בגודל נאות עבור זיהום ויזואליזציה וחזק להתמודד עם15. קרניות חזירים דומות גם למורכבות של מודלים קרניים אנושיים הן בחדירה לקרנית טרנס והן בספיגה מערכתית15. באמצעות מודל זה למחקר, הצלחנו להבהיר כיצד BX795 ראוי לחקירה נוספת כמעכב מוסמך של זיהום וירוס HSV-1 ומוסיף לספרות של סיווגו כתרכובת אנטי ויראלית פוטנציאלית של מולקולה קטנה16.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים הראו BX795 יש תפקיד מבטיח כסוכן אנטי ויראלי נגד זיהום HSV-1; על ידי עיכוב קינאז מחייב טנק 1 (TBK1)16. הן TBK1 והן autophagy שיחקו תפקיד בסיוע לעכב זיהום HSV-1 כפי שהוכח על תאי אפיתל הקרנית האנושית. BX795 הוכח כיעיל ביותר עם פעילות אנטי ויראלית בריכוז של 10μM ושימוש הן ניתוח כתם מערבי וני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 ו- RO1 EY029426) ל- D.S. A.A. נתמך על ידי מענק F30EY025981 ממכון העיניים הלאומי, NIH. המחקר נערך באמצעות קרניות החזירים שהתקבלו מחברת Park Packing, שדרת אשלנד 4107, ניו סיטי, שיקגו, IL-60609
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
