L’explantation de tissu cornéen porcin étudiera l’efficacité des antiviraux du virus de l’herpès simplex-1
Summary
Nous décrivons l’utilisation d’une cornée porcine pour tester l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux.
Abstract
Les virus et les bactéries peuvent causer une variété de défauts de la surface oculaire et de dégénérescence tels que des plaies et des ulcères par infection cornéenne. Avec une séroprévalence qui varie de 60 à 90% dans le monde, le virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV-1) provoque généralement des lésions muco-cutanées de la région orofaciale qui se manifestent également par des lésions et une cécité associée à l’infection. Bien que les médicaments antiviraux actuels soient efficaces, l’émergence d’une résistance et la persistance d’effets secondaires toxiques nécessitent le développement de nouveaux antiviraux contre cet agent pathogène omniprésent. Bien que l’évaluation in vitro fournisse certaines données fonctionnelles concernant un antiviral émergent, elles ne démontrent pas la complexité du tissu oculaire in vivo. Cependant, les études in vivo sont coûteuses et nécessitent un personnel qualifié, en particulier lorsqu’il s’est employé avec des agents viraux. Par conséquent, les modèles ex vivo sont des étapes efficaces mais peu coûteuses pour les tests antiviraux. Nous discutons ici d’un protocole pour étudier l’infection par le HSV-1 en utilisant des cornées porcines ex vivo et d’une méthode pour les traiter par voie topique en utilisant des médicaments antiviraux existants et nouveaux. Nous démontrons également la méthode pour effectuer un dosage de plaque en utilisant HSV-1. Les méthodes détaillées peuvent être utilisées pour mener des expériences similaires afin d’étudier les infections qui ressemblent à l’agent pathogène HSV-1.
Introduction
Les personnes souffrant d’infections oculaires subissent souvent une perte de vision1. Avec une séroprévalence élevée dans le monde entier, les personnes infectées par le HSV souffrent d’infections oculaires récurrentes qui entraînent des cicatrices cornéennes, une kératite stromale et une néovascularisation2,3,4,5. Les infections à HSV ont également montré qu’ils causaient moins fréquemment, une gamme de conditions graves chez les patients immunodéprimés et non traités comme l’encéphalite et la morbidité systémique6,7,8. Des médicaments comme l’acyclovir (VINAIGRE de cidre de pomme) et ses analogues nucléosidiques ont montré un succès constant dans la réduction de l’infection par le HSV-1 et même dans le contrôle de la réactivation, mais l’utilisation prolongée de ces médicaments est associée à une insuffisance rénale, à des anomalies fœtales et à l’incapacité de limiter l’émergence d’une résistance aux médicaments aux souches virales en évolution9,10 , 11,12,13. Les complexités associées aux infections oculaires à HSV-1 ont déjà été étudiées in vitro à l’aide de monocouches et de cultures 3D de cellules cornéennes humaines et in vivo à l’aide d’infections oculaires murines ou de lapin. Bien que ces modèles in vitro fournissent des données significatives sur les composants biologiques cellulaires des infections à HSV-1, ils ne parviennent toutefois pas à imiter la complexité complexe du tissu cornéen et ne font pas grand-chose pour éclairer la propagation dendritique du virus14. En revanche, bien que les systèmes in vivo soient plus perspicaces en montrant la propagation de l’infection dans les cornées et les réponses d’activation immunitaire pendant l’infection par le HSV-1, ils viennent avec la mise en garde qu’ils ont besoin d’enquêteurs formés et de grandes installations pour les soins aux animaux pour ignorer les expériences.
Ici, nous utilisons des cornées porcines comme modèle ex vivo pour examiner le système de plaie induit par l’infection par le HSV-1. La pharmacologie potentielle de certains médicaments ainsi que la biologie cellulaire et moléculaire du système de la plaie causée par l’infection peuvent être étudiées à travers des cultures d’explants tissulaires. Ce modèle peut également être modifié pour l’utilisation d’autres infections virales et bactériennes. Dans cette étude, des cornées porcines ont été utilisées pour tester l’efficacité antivirale d’une petite molécule préclinique, BX795. L’utilisation de cornées porcines a été préférée en raison de la facilité d’accès et de la rentabilité. De plus, les modèles cornéens porcins sont de bons modèles d’yeux humains, les cornées étant faciles à isoler, adéquatement dimensionnées pour l’infection et la visualisation et robustes à manipuler15. Les cornées porcines sont également comparables à la complexité des modèles cornéens humains à la fois dans la perméabilité trans cornéenne et l’absorption systémique15. En utilisant ce modèle pour l’étude, nous avons pu élucider comment BX795 mérite une étude plus approfondie en tant qu’inhibiteur compétent de l’infection par le virus HSV-1 et ajoute à la littérature de le classer comme un composé antiviral potentiel à petitesmolécules 16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des recherches antérieures ont montré que le BX795 joue un rôle prometteur en tant qu’agent antiviral contre l’infection par le HSV-1; en inhibant la kinase 1 (TBK1)16liant TANK. Le TBK1 et l’autophagie ont tous deux joué un rôle dans l’inhibition de l’infection par le HSV-1, comme l’ont démontré les cellules épithéliales cornéennes humaines. BX795 s’est avéré être le plus efficace possible avec une activité antivirale à une concentration de 10 μM et en utilisant à l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions des NIH (R01 EY024710, RO1 AI139768 et RO1 EY029426) à D.S. A.A. a été soutenue par une subvention F30EY025981 du National Eye Institute, NIH. L’étude a été menée en utilisant les cornées porcines obtenues auprès de Park Packing company, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
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