תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר
Summary
כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.
Abstract
Glioblastomas (GBMs), כיתה IV גליומות ממאירות, הם אחד הסוגים הקטלניים ביותר של סרטן אנושי בגלל המאפיינים האגרסיביים שלהם. למרות ההתקדמות המשמעותית בגנטיקה של גידולים אלה, איך תאי GBM לפלוש parenchyma המוח בריא אינו מובן היטב. יש לציין כי הוכח כי תאי GBM פולשים לחלל הצמיגים בדרכים שונות; העניין העיקרי של נייר זה הוא המסלול לאורך דרכי חומר לבן (WMTs). האינטראקציות של תאים סרטניים עם רכיבי תאי העצבים הציצוניים אינן מאופיינים היטב. להלן, שיטה תוארה המעריכה את ההשפעה של נוירונים על פלישת תאים GBM. מאמר זה מציג תרבות משותפת מתקדמת במבחנה המחקה פלישת WMT על ידי ניתוח הנדידה של תאים דמויי גזע GBM על נוירונים. ההתנהגות של תאי GBM בנוכחות נוירונים מנוטרת באמצעות הליך מעקב אוטומטי עם תוכנת קוד פתוח וגישה חופשית. שיטה זו שימושית עבור יישומים רבים, בפרט, עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים, כמו גם לניתוח ההשפעות של סוכנים תרופתיים שיכולים לחסום נדידת תאים GBM על נוירונים.
Introduction
גליומות ממאירות ראשוניות, כולל GBMs, הן גידולים הרסניים, עם שיעור הישרדות בינוני של 12 עד 15 חודשים שדווחו לחולי GBM. הטיפול הנוכחי מסתמך על כריתה גדולה של מסת הגידול וכימותרפיה בשילוב עם הקרנות, אשר רק מאריך את שיעור ההישרדות בכמה חודשים. כשלים טיפוליים קשורים קשר הדוק לאספקת סמים לקויה על פני מחסום הדם – מוח (BBB) ולצמיחה פולשנית בחללים perivascular, קרום המוח, ולאורך WMTs1. פלישה Perivascular, המכונה גם שיתוף כלי דם אפשרות, הוא תהליך נחקר היטב, ואת המנגנונים המולקולריים מתחילים להיות ברורים; עם זאת, תהליך הפלישה לתא GBM לאורך WMTs אינו מובן היטב. תאים סרטניים נודדים למוח הבריא לאורך המבנים המשניים של שרר2. ואכן, לפני כמעט מאה שנה, הנס-יואכים שרר תיאר את הנתיבים הפולשניים של GBM, שכעת מכונים satellitosis פרינורונלי, satellitosis perivascular, התפשטות תת-צינורית, פלישה לאורך WMT (איור 1A).
כמה כימוקינים הקולטנים שלהם, כגון פקטור-1α (SDF1α) ו C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4), אבל לא גורם גדילה אנדותל כלי הדם (VEGF), נראה מעורב פלישת WMT3. לאחרונה, ציר NOTCH1-SOX2 transcellular הוכח להיות מסלול חשוב בפלישה WMT של תאים GBM4. המחברים תיארו כיצד תאים דמויי גזע GBM לפלוש parenchyma המוח על נוירונים unmyelinated חלקית, מה שמרמז על הרס של נדן מיאלין על ידי תאים GBM. אבן דרך הושגה בשנת 2019 כאשר שלושה מאמרים פורסמו בכתב העת Nature, והדגישו את תפקידה של הפעילות החשמלית בפיתוח גליומה5,6. עבודה מכוננת של מונג’ה ומשתפי פעולה שופכת אור על התפקיד המרכזי של פעילות חשמלית בהפרשת נוירוליגין-3, המקדמת פיתוח גליומה.
וינקלר ומשתפי פעולה תיארו קשרים בין תאי GBM (microtubes) להיות חיוני בשלבים פולשניים, ולאחרונה, אינטראקציות בין תאים GBM ותאי עצב באמצעות סינפסות נוירוגליומה שתוארו לאחרונה. מבנים אלה מעדיפים גירוי גלוטמטרגי של קולטני α אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic (אמפא) הממוקמים בקרום התא GBM, המקדם התפתחות גידולים ופלישה. פלישת תאים סרטניים היא תהליך מרכזי בהפצת גרורות או מוקדים משניים מרוחקים, כפי שנצפה בחולי GBM. מספר גורמים זוהו להיות חשובים פלישת GBM כגון תרומבוספונדין-1, בטא גורם גדילה טרנספורמציה (חלבון מטריקוולרי מוסדר TGFβ, או קולטן כימוקין CXCR3)7,8.
כאן, מודל ביומימטי פשוט תואר לחקר פלישת GBM, שבו נוירונים מעוצבים על עקבות של למין, ותאי GBM נזרעים עליו, כתאים בודדים או כספרוידים(איור 1B). שתי ההגדרות הניסיוניות נועדו לשחזר את הפלישה לנוירונים, אשר נצפתה ב GBM9,10,11. מודלים כאלה פותחו בעבר כמו ביו-חומרים nanofiber מיושר (electrospinning קליפת ליבה) המאפשרים ללמוד נדידת תאים על ידי אפנון תכונות מכניות או כימיות12. מודל התרבות המשותפת המתואר במאמר זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו תאי GBM בורחים על נוירונים על ידי הגדרת מסלולים מולקולריים חדשים המעורבים בתהליך זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glioblastomas לפלוש בהרחבה parenchyma באמצעות מצבים שונים: אפשרות משותפת של כלי הדם שמסביב, פלישה ביניים, או פלישה על WMTs18. מצב זה אינו מאופיין היטב בספרות בגלל הקושי למצוא מתאים במבחנה או במודלים vivo הקשורים פלישת WMT. כאן, מודל פשוט הוצע שבו נוירונים מכרסמים מתורבתים היו בדוגמת על…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פונדציה ARC 2020, ליגה קונטרה לה סרטן (Comite de la Gironde), ARTC, תוכנית סרטן 2021, INCA PLBIO. Alveole נתמך על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche (גרנט Labex מוח ANR-10-LABX-43). ז’וריס גיאון הוא מקבל מלגת בית החולים האוניברסיטאי טולוז (CHU טולוז).
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
